Här presenterar vi ett protokoll för att generera en 3D organotypic melanom sfäroid hud modell som recapitulates både arkitekturen och flercelliga komplexiteten av en orgel/tumör i vivo men samtidigt rymmer systematisk experimentell ingripande.
Elakartad omformning av melanocyter, cellerna med pigment av mänsklig hud, orsakar bildandet av melanom, en mycket aggressiv cancer med ökad metastatisk potential. Nyligen, mono-kemoterapier fortsätta att förbättra genom melanom specifika kombinationsbehandlingar med riktade kinashämmare. Metastaserande melanom är fortfarande, en livshotande sjukdom eftersom tumörer uppvisar primär resistens eller utveckla resistens mot nya terapier, därmed återfå tumörframkallande kapacitet. För att förbättra terapeutiska framgången av malignt melanom, är bestämning av molekylära mekanismer som ger resistens mot konventionella behandlingsmetoder nödvändig. men, det kräver innovativa cellulära in vitro- modeller. Här, vi införa en in vitro- tredimensionella (3D) organotypic melanom sfäroid modell som kan skildra i vivo arkitekturen av malignt melanom och kan motivera nya insikter i intra-tumoral samt tumör-värd-interaktioner. Modellen innehåller definierade antal mogna och differentierade melanom spheroids i 3D full människohud återuppbyggnad modell bestående av primära hudceller. De inbäddade melanom spheroids cellulära sammansättningen och differentiering status är liknande till en av kutana melanom metastaser i vivo. Med denna organotypic melanom sfäroid modell som en drog som screening plattform kan stödja identifiering av responders till valt kombinationsbehandlingar, samtidigt skona onödig behandling bördan för icke-responders, därigenom öka nyttan av Terapeutiska interventioner.
Den mänskliga huden består av två skilda fack som fyller olika funktioner för att skydda kroppen från skadliga miljöeffekter1. Lägre dermal kupén består av en fibro-elastisk bindväv. Den består av löst sammanhållen kollagen och elastin fibrer som syntetiseras av fibroblaster, som serverar en mekanisk barriär-funktion. Dermis är separerad från övre epidermis av den basala lamina som produceras som ett extracellular matris på grund av en ständig kommunikation mellan båda hud fack. I motsats till dermis, epidermis är ett skivepitel som främst består av keratinocyter och kan göras åtskillnad mellan in i fyra lager. I stratum basale består av odifferentierade basala keratinocyter som ständigt följer hudens stamceller stratifiera genom de olika stadierna av stratum spinosum och stratum granulosum i stratum corneum att skydda kroppen mot uttorkning och infektioner2. Melanocyter justeras på basala membranet och kommunicera via dendritiska förlängningar med flera keratinocyter. De producerar pigmentet melanin för att skydda huden vävnad från de skadliga effekterna av UV-strålning, som hudens åldrande, immunsuppression, inflammation och induktion av icke-melanom hudcancer. UV strålning bidrag till omformningen av melanocyterna till malignt melanom, men är fortfarande under debatt3.
Melanom utveckling är differentierade i olika tumör progression etapper, och kännetecknas av vissa genetiska, morphologic och histologiska förändringar4. De har sitt ursprung antingen de novo eller från en medfödd eller förvärvad nevus på grund av en lokal ökning av melanocyte spridningen orsakar godartade tumörer. Denna föregångare lesion kan konvertera till strukturellt modifierade dysplastiska vävnad innehållande atypic celler, som får fortsätta att maligna etapp, radiella tillväxtfasen (RGP). Denna tidiga tumör progression fas kännetecknas av celler radiellt frodas inom epidermis, visar några lokalt invasiv celler inom papillär dermis. Under efterföljande vertikal tillväxt fas (VGP) melanom visar celler redan en metastaserande och invasiv fenotyp genom att bryta igenom den basala lamina att infiltrera de djupa delarna av dermis samt den subkutana vävnad5. Slutligen representerar metastaserande melanom (MM) mest aggressiva progression scenen med metastaserande celler systemiskt sprider sig i blod- och lymfa systemet att invadera distalt organ såsom lever, lungor och hjärna6.
Hittills har tidig diagnos följt av kirurgi är fortfarande den mest effektiva behandlingen av malignt melanom. Prognosen för patienter med fjärrmetastaser, förblir dock särskilt dålig7, eftersom klassisk kemoterapiregimer ger endast lite överlevnad nytta8,9. Dock efter decennier av stagnation, har senaste framstegen inom riktade terapier avsevärt förbättrat prognosen för malignt melanom.
Dysreglering av två stora mitogen aktiveras spridningsvägar, den RAS-RAF-MEK-ERK och signalvägar som PI3K-AKT-PTEN, presentera viktiga drivkrafter för melanom progression, särskilt när konstitutivt aktivera punktmutationer av den proto-onkogener BRAFV600 och Regleringsmyndigheterna är närvarande10. Därför lovade uppfinningen av riktade kinashämmare terapeutiska fördelar för patienter med metastaserande melanom. En mångfald av kliniska prövningar som utförs på denna punkt har inte uppnått betydande fördelar för patienter med metastaserande melanom. Nästan alla svaren är partiska, med en subpopulation av patienterna visar primär resistens. Dessutom hos förvärv av sekundära motstånd leder till återfall majoriteten av patienter11,12.
Det blir tydligt att analys av mutationsstatus ensam inte är tillräcklig för att utveckla den mest potenta terapeutisk strategin. Nya snabba och tillförlitliga diagnostiska verktyg är nödvändiga för att systematiskt registrera och analysera lyhördheten för enskilda cancerceller. Majoriteten av för närvarande tillgängliga uppgifterna om mänskliga melanom har erhållits från tvådimensionell (2D) melanom cellkulturer. Tumörceller, dock vuxit i 3D Tillåt intercellulära överhörning mellan differentierad cancer cell subpopulations samt mellan cancerceller och icke-omvandlad omgivande värd vävnad. Därför skulle det vara bäst att rekonstruera 3D-miljö där melanom utvecklas, för att användas som en preklinisk screening modell13,14.
Organotypic melanom sfäroid hud modell införs här garanterar nya insikter för en djupare förståelse av intra-tumoral och tumör-host interaktion, och föreskriva en avancerad screening plattform för att studera molekylära mekanismer för tumörutveckling och terapimotstånd i framtiden.
Att garantera bäst fysiologiska och i vivo härma villkor av hud rekonstruerar, kvaliteten på de primära cellerna är av yttersta vikt. Som nämnts ovan, juvenil eller prenatala hudceller Visa lägsta differentiering betyget och passar därför bäst att generera fullhudsskador hud medel. Första möjliga kvalitetskontroll är omfattningen av dermal kontraktion vid dag 2 efter sådd keratinocyter och equilibrating gelen till extra bolagsstämma (protokoll avsnitt 8.2 och 8.3). Dermal geler krymper mest med den bästa kvaliteten av fibroblaster. Också, försämra integrationen av för få eller för många fibroblaster dermal kontraktion och följaktligen fastsättning av den epidermala dermal facket. Detta kommer att i sin tur äventyra epidermal differentiering, eftersom denna process kräver en omfattande överhörning mellan dermala och epidermala celler.
Kvaliteten på primära celler är också kritiskt beroende av den cellen konfluens samt passagen av cellerna. Om keratinocyter odlas till ≥80% konfluens de omedelbart stoppa allt fler och börja att skilja. Det är därför viktigt att kultur dem till 40-70% konfluens under passaging och använda dem nej senare än passage 3-4. Fibroblaster är mindre känsliga men bör inte användas senare än passage 4-6. Observera även att alla primära celler och cellinjer som används för att generera organotypic melanom sfäroid hud modeller är odlade utan antibiotika, och därför förorening risken är hög. Men tillägg av antibiotika ändras physiologyen av de enskilda cellerna och därför minskar kvaliteten på huden motsvarigheterna.
I allmänhet är sfäroid tumörbildning möjligt från nästan alla typer av tumör cellinjer och även från tumörceller nymalen isolerade från patientmaterial. Den initiala cell och/eller odling tid för att få optimal sfäroid storlekar kan variera beroende på vilken celltyp används. Upp till 150-200 µm, kan alla celler som ingår i en sfäroid fortfarande tillräckligt levereras med näringsämnen via enkel diffusion. Endast spheroids med storlekar ≥500 µm visar en hög grad av celldifferentiering och representerar typiska drag av icke-vaskulariserad tumör vävnad22.
Organotypic melanom-sfäroid-hud-modellen utvecklades här är särskilt lämpliga att studera tumör-host interaktioner och för melanom drogtester under in-vivo-gillar villkor15. Ändå är miljön av melanom i vivo ännu mer komplex, hyser en mängd tumör associerade celltyper, däribland immunceller och endotelceller. Eftersom tillägg av ordentlig primära immunceller står inför problem med histocompatibility, ännu dessa modeller inte möjlighet att på lämpligt sätt övervaka immun-terapeutiska metoder.
Dock melanom spheroids kan genereras från färska isolerade patientmaterial och när ingår i den fullständiga hud rekonstruera, kan tjäna som enskilda drog screening plattformar. Även integrering av bitar av melanom metastaser i huden rekonstruerar är tänkbart att testa läkemedelskombinationer i en skräddarsydda behandlingsmetoder. Inklusive organotypic 3D hudmelanom modellen i prekliniska tester kommer sannolikt att bidra till att säkerställa att endast de mest lovande nya terapeutiska koncept tas fram i kliniska tester, därmed minska förslitningen andelen potentiella nya behandlingar för detta sjukdom och öka graden av terapeutisk framgång i kliniska prövningar.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Hanna Voersmann för att upprätta den 3D organotypic melanom-sfäroid-hud-modellen och ger utmärkt protokoll. Författarna också tacka Silke Busch för värdefull teknisk support. Arbetet stöddes av BMBF e: Med programmet ”melanom känslighet” 031A423A.
fetal serum albumin (FCS) | Thermo Fisher Scientific | 10270106 | add 10 % to cell culture medium |
Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | 1X dilute in PBS |
RPMI | Thermo Fisher Scientific | 61870010 | for cultivation of melanoma cell lines |
DMEM | Thermo Fisher Scientific | 41965062 | for cultivation of primary fibroblasts |
Dispase | Gibco life technologies | 17105041 | 2U/ml, dissolve in PBS |
Collagen type I | BD Biosciences | 354249 | usually from rat tail, concentration should be 3.5-4 mg/ml |
24-well inserts Nunclon | Nunc | 140629 | 8 µm pore size; use standing, not hanging inserts! |
cell strainer | BD Falcon | 352360 | yellow |
Gentamycine | Thermo Fisher Scientific | 15750060 | dissolve in PBS |
Keralife keratincyte medium | Cell Systems | do not add FCS or antibiotics | |
Collagenase | SERVA | 17454 | NB4 standard grade |
juvenile human keratinocytes | Cell Systems | FC-0007 | alternative to own preparation from juvenile foreskin |
juvenile human fibroblasts | Cell Systems | FC-0001 | alternative to own preparation from juvenile foreskin |
DMEM [+] 4,5 g/l Glucose, [+] L- Glutamine, [-] L- Pyruvate |
Gibco life technologies | 41965 | mix 1:1 with Ham´s F-12 for MM medium; mix 3:1 with Ham´s F-12 for EGM medium |
Ham´s F-12 [+] L-Glutamine | Gibco life technologies | 21765-029 | add to DMEM for the generation of EGM and MM medium (see lane 15) |
EGF | Gibco life technologies | 13247-051 | add 10 ng/ml only for the generation of EGM medium |
Calcium chloride | Merck Chemicals | 2381 | add 1.9 mM for the generation of EGM and 3.8 mM for MM medium |
Selenic acid | Alfa Aesar | 18851 | add 53 nM for the generation of EGM and MM medium |
Insulin | Lilly | HI0219 Hum Pen 3ml 100 E.I./ml | add 5 µg/ml for the generation of EGM and MM medium |
Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E-0135 | add 0.1 mM for the generation of EGM and MM medium |
P-Ethanolamine | Sigma-Aldrich | P-0503 | add 0.1 mM for the generation of EGM and MM medium |
Holo-Transferrine | Sigma-Aldrich | T-0665 | add 5 µg/ml for the generation of EGM and MM medium |
Triiodthyronine | Sigma-Aldrich | T-6397 | add 20 pM for the generation of EGM and MM medium |
Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H-088816 | add 0.4 µg/ml for the generation of EGM and MM medium |
Progesterone | Sigma-Aldrich | P-8783 | add 10 nM only for the generation of EGM medium |
Hepes | Sigma-Aldrich | H-3784 | add 15 mM for the generation of EGM and MM medium |
Serine | Sigma-Aldrich | S-4311 | add 1 mM for the generation of EGM and MM medium |
Cholinchloride | Sigma-Aldrich | C-7017 | add 0.64 mM for the generation of EGM and MM medium |
dFCS | Sigma-Aldrich | F-0392 Lot 086K0361 | add 2 % for the generation of EGM and MM medium |
Adenine | Sigma-Aldrich | A-9795 | add 0.18 mM for the generation of EGM and MM medium |
L-Glutamine | PromoCell | C-42209 | add 7.25 mM for the generation of EGM and MM medium |
Strontiumchloride | Sigma-Aldrich | 255521 | add 1 mM for the generation of EGM and MM medium |
anti cytokeratin 10 antibody | Dako | M7002 | 1:50 |
anti cytokeratin 14 antibody | Santa Cruz | sc-53253 | 1:200 |
anti laminin 5 antibody | Santa Cruz | sc-32794 | 1:50 |
anti filaggrin antibody | Thermo Fisher Scientific | MA5-13440 | 1:50 |
anti involucrin antibody | Acris Antibodies | AM33368PU | 1:50 |
secondary polyclonal goat anti-mouse IgG FITC labeled | LifeSpan Biosciences | LS-C153907 | 1:50 |
secondary polyclonal goat anti-mouse IgG Cy3 labeled | Jackson Immuno Research | 115-165-003 | 1:1000 |
DAPI | Sigma-Aldrich | 10236276001 | 1:100 |