Vi præsenterer her, en robust og optimeret protokol for produktion af milligram mængder af indfødte, tag-gratis monomerer og fibriller af exon1 af Huntingtin-protein (Httex1) baseret på den forbigående fusion af små ubiquitin relaterede modifier (SUMO).
Huntington’s chorea (HD) er en arvelig dødelig neurodegenerativ sygdom forårsaget af en CAG-udvidelse (≥36) i den første exon af HD-genet, hvilket resulterer i udtryk for Huntingtin-protein (Htt) eller N-terminale fragmenter heraf med en udvidet polyglutamin ( polyQ) strækning.
Exon1 af Huntingtin-protein (Httex1) er den mindste Htt-fragment, der sammenfatter mange af funktionerne i HD i cellulære og dyre modeller og er en af de mest studerede fragmenter af Htt. Den lille størrelse af Httex1 gør det eksperimentelt mere medgørlige til biofysiske karakterisering ved hjælp af standard og høj opløsning teknikker i forhold til længere fragmenter eller fuld længde Htt. Høj sammenlægning tilbøjelighed mutant Httex1 (mHttex1) med øget polyQ indhold (≥42) har imidlertid gjort det vanskeligt at udvikle effektive udtryk og vandrensningssystemer til at producere disse proteiner i tilstrækkelige mængder og gøre dem tilgængelige for forskere fra forskellige discipliner uden brug af fusion proteiner eller andre strategier, der ændrer den oprindelige sekvens af protein. Vi præsenterer her en robust og optimerede metode til produktion af milligram mængder af indfødte, tag-gratis Httex1 baseret på de forbigående fusion af små ubiquitin relaterede modifier (SUMO). Enkelhed og effektivitet af strategien vil eliminere behovet for at bruge ikke-hjemmehørende sekvenser af Httex1, således at gøre dette protein mere tilgængeligt for forskere og forbedre reproducerbarhed af eksperimenter på tværs af forskellige laboratorier. Vi mener, at disse fremskridt vil også fremme fremtidige undersøgelser sigter mod at belyse struktur-funktion relationer i Htt samt udvikle nye diagnostiske værktøjer og behandlingsformer til at behandle eller bremse udviklingen af HD.
HTT er et protein, 348 kDa og har været involveret i flere fysiologiske funktioner1. Når Htt indeholder en udvidet polyQ regionen i mere end 36 restkoncentrationer i sin N-terminus, forårsager det HD2,3. HD patologi er karakteriseret af cellulære optagelser i striatum og cortex, som fører til neuronal død og atrofi af det berørte væv4,5. Flere N-terminale Htt fragmenter, der indeholder polyQ gentage tarmkanalen er blevet påvist i post mortem hjerner fra HD-patienter og menes at være genereret af proteolytiske behandling af huntingtin protein6. Nylige undersøgelser tyder på at Httex1 også kunne dannes som følge af afvigende mRNA-splicing. Httex1 indeholder den patologiske polyQ mutation og dens overekspression i dyr kan sammenfatte mange af de vigtigste funktioner i HD7, hvilket understreger en mulig centrale rolle i dette fragment i HD patologi og sygdom progression6, 8,9.
På grund af høje sammenlægning tilbøjelighed mutant Httex1 (mHttex1) med udvidet polyQ tarmkanalen, størstedelen af eksisterende udtryk systemer er baseret på den forbigående fusion af Httex1 til proteiner (f.eks glutathion-S-transferase (GST), thioredoxin (TRX) eller maltose-bindende-protein (MBPS) og/eller peptider (poly-histidin), varierende forbedre dens udtryk, stabilitet, rensning og/eller opløselighed10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26,27,28. Fusion partner er knyttet til Httex1 med en kort sekvens der indeholder en spaltning site for proteaser som trypsin, tobak etch virus (TEV) protease eller PreScission til at tillade kavalergang og frigivelse af Httex1 forud for indledningen af sammenlægning eller rensning. Mangler disse metoder omfatter mulighed for yderligere restkoncentrationer på grund af ikke-traceless kavalergang og oprettelsen af trunkerede fragmenter på grund af miscleavage inden for sekvensen af Httex1, ud over heterogenitet på grund af ufuldstændige kavalergang ( Se Vieweg et al. for mere tilbundsgående diskussion om de fordele og begrænsninger ved denne fremgangsmåde)10. For at løse disse begrænsninger, udviklet vi for nylig et udtryk strategi muliggør generation af tag-fri indfødte Httex1 for første gang ved at udnytte en forbigående N-terminale fusion af Synechocystis sp. (Ssp) DnaB intein til Httex110. Mens intein kavalergang er traceless og specifikke og udbytter mg mængden af proteiner, det stadig lider to ulemper, der kan reducere udbyttet: nemlig, for tidlig spaltning af den intein, som kan opstå under udtrykket, og det faktum, at spaltning opstår over flere timer, hvilket kunne føre til tab af protein som følge af sammenlægning, især for Httex1 med udvidet polyQ gentagelser.
At løse disse begrænsninger og raffinere vores strategi for produktion af indfødte tag-fri Httex1, vi udviklet et nyt udtryk system baseret på den forbigående fusion af SUMO, mere præcist gær homolog Smt3 til Httex1. Anvendelsen af SUMO system til produktion af rekombinante proteiner blev først offentliggjort i 200429, hvor en øget hyppighed af udtryk og Opløselighed af SUMO fusion protein blev demonstreret. SUMO tag kan kløves af proteaser ubiquitin som protein-specifikke protease 1 (ULP1), som ikke kræver en genkendelsessekvens, men genkender den tertiære struktur af SUMO og praktisk talt eliminerer muligheden for miscleavage30. Desuden en ULP1-medieret kavalergang er hurtig og traceless og efterlader ikke yderligere rester. Tidlig kløvningen af fusion-tag, undgås som observeret med autocatalytic intein10, helt ved kravet om en ekstern protease. Mens SUMO strategien er i dag udbredt for rekombinante protein produktion31,32,33, demonstrere vi i dette papir, det er især nyttigt for generation af et uløseligt uorganiseret, sammenlægning-liggende, amyloidogenic protein som Httex1. Vi mener, at enkelhed, effektivitet og robusthed af vores SUMO-fusion-baseret metode vil gøre indfødte, tag-gratis Httex1 mere tilgængeligt for forskere fra forskellige discipliner og eliminere behovet for at bruge ikke-hjemmehørende sekvenser af Httex1 in vitro- . Dette er et vigtigt fremskridt, der vil lette fremtidige undersøgelser for at belyse struktur-funktion relationen af Httex1.
Protokollen beskriver rensning af Httex1 fra 12 L bakteriekultur, men protokollen kunne tilpasses nemt for mindre eller større skala produktioner. Protokollen beskriver produktion af vildtype Httex1 (wtHttex1) med en polyQ repeatlængde nedenfor (23Q) og mutant Httex1 (mHttex1) med en polyQ gentage længde ovenfor (43Q) den patogene tærskel (36Q).
I denne protokol, vi har skitseret en effektiv procedure for indsamling milligram mængder af indfødte, umærkede Httex1 der indeholder 23 eller 43 glutamin rester. Dette blev opnået ved at udtrykke Httex1 som en C-terminale fusion til en hans6-SUMO tag, som bruges til at isolere fusion protein fra cellen lysate af IMAC og er kløvet før HPLC rensning af Httex1. Mens SUMO strategien er blevet brugt i produktionen af flere andre proteiner, viser vores metode, at de unikke egenskaber SUMO kunne også bruges til at generere uløseligt uordnede, sammenlægning-liggende, amyloidogenic protein, der tidligere har vist sig at være yderst vanskeligt at håndtere og producere43,44. Vi præsenterer en protokol, der er ligetil, let at bruge og kan sammenlignes med en protokol for generation af en “velopdragne” protein. SUMO fusion solubilizes og stabiliserer Httex1 under udtryk og IMAC rensning trin. Tidlig kløvningen af tag, som observeres med intein strategi10 og sammenlægning ikke længere et problem.
Uløseligt uordnede proteiner er særligt udsatte for nedbrydning. Mens N-terminale nedbrydning i regionen N17 ikke er et problem, der bruger denne protokol, kan udeladelser i PRD Httex1 forekomme. Som de afkortede proteiner er meget lig Httex1 i hydrophobicity, beregning og størrelse, at fjerne dem ved kromatografisk midler er udfordrende, derfor er det bedst at forhindre deres dannelse i første omgang. Holder sig tæt til protokollen, bør altid arbejder på is og ved hjælp af en tilstrækkelig mængde af protease hæmmer hjælpe med at holde niveauet af observerede trunkering meget lav. Anvende en fusion tag fra C-endepunktet for Httex1 kunne fjerne udeladelser i PRD let som den afkortede protein ville miste koden affinitet. Men hvis de indfødte sekvens skal fastholdes denne indstilling ikke kan anvendes som Httex1 ender med prolin og til bedste af vores viden der er ingen C-terminale fusion tags, der er kendt for at inducere traceless og effektiv kavalergang efter prolin.
Den mest kritiske del af protokollen er håndteringen af Httex1 befriet efter spaltning af SUMO tag af ULP1. Protein bør renses straks af RP-HPLC. Heldigvis, dette er en effektiv og hurtig reaktion, der er normalt udført i 10-20 min. ved 4 ° C. Derimod intein strategi kræves flere timer til fuldstændig spaltning af intein, hvilket kræver en afvejning mellem ufuldstændige kavalergang og begyndelsen sammenlægning for at maksimere udbyttet. En hurtig workup er påkrævet for mutant Httex1, som det vil begynde at samle på den relativt høje koncentration i kavalergang reaktion, der henviser til, at 23Q varianten er stabile i længere tid. Under RP-HPLC rensning, en anden fordel ved SUMO bliver tilsyneladende: mens Ssp DnaB intein er hydrofobe og stikker stærkt til kolonnen, SUMO er mere hydrofil og eluerer helt fra C4 omvendt-fase kolonne. Selv om kommercielle ULP1 er ganske dyrt, kan proteinet fremstilles nemt i højt udbytte efter tidligere publicerede protokoller29.
Den afgørende betydning af at anvende en opdeling protokol før ved hjælp af Httex1 kan ikke understreges nok. Frysetørret polyQ proteiner som Httex1 er stabil og kan være gemt lange perioder, men er ikke helt opløseligt i vand og buffere. Tilstedeværelsen af præfabrikerede oligomerer eller fibriller kunne have en betydelig indvirkning på sammenlægning kinetik og Biofysisk egenskaber af protein45. Opdeling protokollen beskrevet her tillader opdeling af proteiner, fjernelse af præfabrikerede aggregater og generering af en opløsning af monomere Httex1 fra et frysetørret prøve. Vi observeret lignende sammenlægning kinetik og fibril morfologi for Httex1 fremstillet med SUMO og intein strategi.
I forhold til tidligere metoder til at producere Httex1, SUMO strategi beskrevet her giver flere fordele og udvider vifte af mulige undersøgelser at undersøge strukturen og funktionelle egenskaber af dette protein i sundhed og sygdom. SUMO-Httex1 fusion protein er let at håndtere, det kan frosne og gemt eller holdes i løsning i 24 timer ved stuetemperatur, mens den gratis mHttex1 ville samle hurtigt. Stabilitet og høj opløselighed af SUMO-Httex1 fusion proteiner giver større fleksibilitet for at manipulere proteinet og/eller indføre enzymatiske og kemiske ændringer i mHttex1, der ellers ikke ville være muligt efter kavalergang. Dette omfatter indførelsen af posttranslationelle modifikationer, fluorophores, spin etiketter, biotin tags m.m. de forskud, der præsenteres her bør 1) lette fremtidige undersøgelser for at belyse struktur-funktion relationer i Httex1; 2) generere nye værktøjer til at undersøge Htt sammenlægning og patologi udbredelse; 3) muliggør udvikling af nye assays til at identificere molekyler, som kan stabilisere mutant Httex1 og forhindre dens sammenlægning; og 4) tilskynde forskere fra andre felter til at bringe til at arbejde på dette protein og deltage i vores søgen efter at finde behandlinger for Huntington’s chorea.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev finansieret primært ved tilskud fra CHDI-fonden og den schweiziske National Science Foundation. Vi takker Dr. Sophie Vieweg for nyttige diskussioner under udviklingen af dette nye udtryk og andre medlemmer af gruppen Lashuel for at dele deres erfaringer med dette udtryk system og for deres input og værdifuld feedback. Vi takker også Prof. Oliver Hantschel give ULP1 plasmid. Forfatterne takke Dr. John B. Warner og Dr. Senthil K. Thangaraj til kritisk gennemgang af håndskriftet
Uranyl formate (UO2(CHO2)2) | EMS | 22450 | |
Formvar/carbon 200 mesh, Cu 50 grids | EMS | FCF200-Cu-50 | |
High Precision Cell made of Quartz SUPRASIL 1 mm light path from Hellma Analytics | HellmaAnalytics | 110-1-40 | |
Buffer Substance Dulbecco's (PBS w/o Ca and Mg) ancinne ref 47302 (RT) SERVA | Witech | SVA4730203 | |
Ampicillin | AxonLab | A0839.0100 | |
Luria Broth (Miller's LB Broth) | Chemie Brunschwig | 1551.05 | |
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | AxonLab | A1008.0025 | |
E. coli B ER2566 | NEB | NEB# E4130 | |
Imidazole | Sigma | 56750-500G | |
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693116001 | |
Anti-Huntingtin Antibody, a.a. 1-82 | Merck Millipore Corporation | MAB5492 | |
IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG (H + L) | Licor | 925-68070 | |
PMSF | AxonLab | A0999.0005 | |
HisPrep 16/10 column | GE Healthcare | 28936551 | |
C4 HPLC column | Phenomenex | 00G-4168.P0 | 10 µm C4 300 Å, LC Column 250 x 21.2 mm, Phenomenex, 19×10 mm guard column, not temperature jacketed |
Acetonitrile HPLC | MachereyNagel | C2502 | |
Filtre seringue Filtropur S 0,45 ul sans prefiltre sterile | Sarstedt AG | 83.1826 | |
Spectrophotometer semi-micro cuvette | Reactolab S.A. | 2534 | |
Superloop, 1/16" fittings (ÄKTAdesign), 50 ml | GE Healthcare | 18111382 | |
Trifluoroacetic acid | Sigma | 302031 | |
GREINER Tubes fo FPLC 16 x 100 mm, cap. 12.0 ml | Greiner Bio-One | 7.160 102 | |
100 kD Microcon fast flow filters | Merck Millipore Corporation | MRCF0R100 | |
Vibra-cell VCX130 ultrasonic liquid processor | Sonics | ||
Äkta 900 equipped with a fraction collector | GE Healthcare | ||
Jasco J-815 Circular Dichroism | Jasco | ||
Waters UPLC system | Waters | C8 BEH acquity 2.1×100 mm 1.7 micron column , preheated column (40 °C), flow rate of 0.6 mL/min, injection volume of 4 μL | |
waters HPLC system | Waters | 2489 UV detector and 2535 quaternary gradient module, 20 mL loop in a FlexInject housing | |
ESI-MS: Finnigan LTQ | Thermo Fisher Scientific | ||
lyophylizer instrument | FreeZone 2.5 Plus | ||
Tecnai Spirit BioTWIN | FEI | electron microscope equipped with a LaB6 gun and a 4K x 4K FEI Eagle CCD camera (FEI) and operated at 80 kV | |
37 °C shaking incubator | Infors HT multitron Standard | ||
Biophotometer plus | Eppendorf |