כאן, אנו מציגים פרוטוקול ממוטבת ועמיד לייצור כמויות מיליגרם של מונומרים מקורי, ללא תג, הסיבים של exon1 של החלבון Huntingtin (Httex1) המבוסס על הפיוז’ן ארעית של צירוף קשורים אוביקוויטין קטן (סומו).
מחלת הנטינגטון (HD) היא מחלה תורשתית ניווניות קטלנית הנגרמת על ידי הרחבה החטיבה (≥36) ב אקסון הראשון של הגן HD, והתוצאה היא הביטוי של החלבון Huntingtin (Htt) או N-מסוף קטעים הימנו עם (polyglutamine המורחב מתיחה polyQ).
Exon1 של החלבון Huntingtin (Httex1) נמצא השבר Htt הקטן ביותר זה recapitulates רבות מהתכונות של HD בסלולר, חיה מודלים, נמנה שברי למדה הנפוצים Htt. גודל קטן של Httex1 הופך השפעול יותר נוטה biophysical אפיון באמצעות טכניקות סטנדרטי, רזולוציה גבוהה לעומת קטעים ארוכים או Htt באורך מלא. עם זאת, צבירת גבוהה נטיה של מוטציה Httex1 (mHttex1) עם תוכן מוגבר polyQ (≥42) הפכה אותו קשה לפתח ביטוי יעילה ומערכות טיהור לייצר חלבונים אלה בכמויות מספיקות ולגרום להם נגיש מדענים מתחומים שונים ללא שימוש פיוז’ן חלבונים או שיטות אחרות שמשנות את רצף מקורית של החלבון. אנו מציגים כאן שיטה חזקה ממוטב הייצור של כמויות מיליגרם של ילידים, תג בחינם Httex1 מבוסס על הפיוז’ן ארעית של צירוף קשורים אוביקוויטין קטן (סומו). הפשטות והיעילות של האסטרטגיה יבטל את הצורך להשתמש שנוצרה רצפים של Httex1, ובכך הפיכת חלבון זה יותר נגיש לחוקרים ושיפור הפארמצבטית את הניסויים בין מעבדות שונות. אנו מאמינים כי ההתפתחויות הללו גם יקל על מחקרים עתידיים מכוון שחקרתי את הקשר מבנה פונקציה של Htt וכן בפיתוח כלי אבחון הרומן של טיפולים לטיפול או להאט את ההתקדמות של HD.
Htt הוא חלבון 348 kDa, היה מעורב פונקציות פיזיולוגיים מספר1. Htt כוללת אזור polyQ המורחב של שאריות יותר מ 36 אמיני שלה, היא גורמת HD2,3. פתולוגיה HD מאופיין תכלילים הסלולר סטריאטום ואת קליפת המוח, אשר מוביל למוות עצביים, ניוון של רקמות המושפעת4,5. מספר קטעים N-מסוף Htt המכילים את דרכי חזרה polyQ זוהו במוח פוסט-מורטם מחולים HD, הם חשבו להיות שנוצר על-ידי עיבוד הפרוטאוליטי של חלבון huntingtin6. מחקרים שנעשו לאחרונה מראים כי Httex1 גם יכול להיווצר עקב החדרת ה-mRNA חריגה. Httex1 מכיל את המוטציה polyQ פתולוגית, שלה ביטוי אצל בעלי חיים יכולים לסכם רבים של התכונות העיקריות של HD7, ובכך הארת תפקיד מרכזי אפשרי של קטע זה ב HD פתולוגיה ומחלות התקדמות6, 8,9.
עקב צבירת גבוהה נטיה של מוטציה Httex1 (mHttex1) עם polyQ המורחב בדרכי, הרוב המכריע של מערכות קיימות ביטוי מבוססים על הפיוז’ן ארעית של Httex1 חלבונים (כגון גלוטתיון-S-טרנספראז (GST), thioredoxin (TRX) או מלטוז-מחייב-חלבון (MBP) ו/או פפטידים (פולי-היסטידין) באופן שונה לשפר את הביטוי, יציבות, טיהור ו/או מסיסות10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26,27,28. הזוג פיוז’ן מקושר Httex1 עם רצף קצר המכיל אתר המחשוף פרוטאזות כמו טריפסין, tabacco לחרוט פרוטאז וירוס (אס) או PreScission כדי לאפשר המחשוף ושחרור של Httex1 לפני אתחול של צבירת או טיהור. החסרונות של שיטות אלה כוללים את האפשרות להשאיר משקעים נוספים בשל מחשוף traceless ויצירת של קטעים שנחתכו עקב miscleavage בתוך הרצף של Httex1, בנוסף הטרוגניות עקב המחשוף לא שלם ( ראה Vieweg et al. . לדיון מעמיק יותר על היתרונות ועל המגבלות של גישה זו)10. כדי לטפל מגבלות אלה, שפיתחנו לאחרונה אסטרטגיית הבעה המאפשרת את הדור של Httex1 ללא תג מקורית בפעם הראשונה על-ידי ניצול פיוז’ן N-מסוף ארעית של Synechocystis sp. (Ssp) Intein DnaB Httex110. בעוד המחשוף intein הוא traceless, מדויקת, התשואות mg בכמות החלבונים, היא עדיין סובלת שני החסרונות יכול להפחית את התשואה: כלומר, מוקדמת המחשוף של intein אשר יכול להתרחש במהלך הביטוי, ואת העובדה המחשוף מתרחשת מעל שעות מספר, אשר יכול להוביל לאובדן חלבון עקב צבירת, במיוחד עבור Httex1 עם polyQ המורחב חזרה.
כדי לטפל מגבלות אלה וכדי לחדד את האסטרטגיה שלנו לייצור של מקורי, ללא תג Httex1, פיתחנו מערכת ביטוי חדשה המבוססת על הפיוז’ן ארעית של הסומו, יותר בדיוק השמרים homolog Smt3 כדי Httex1. היישום של מערכת סומו לייצור של חומרים פורסם לראשונה ב 200429, שבה הודגם שיעור מוגבר של הביטוי, המסיסות של חלבון כימרי סומו. יכול להיות ביקע התג סומו מאת אוביקוויטין כמו חלבון ספציפי פרוטאז 1 (ULP1), אשר אינו דורש אתר הכרה, אבל מזהה את מבנה שלישוני של סומו, למעשה מבטלת את האפשרות של miscleavage30. יתר על כן, המחשוף בתיווך ULP1 מהיר, traceless, אינו משאיר משקעים נוספים. המחשוף מוקדמת של התג פיוז’ן, כפי שנצפה עם autocatalytic intein10, לחלוטין נמנעת על ידי הדרישה פרוטאז חיצוניים. ואילו האסטרטגיה סומו משמש כיום נרחב חלבון רקומביננטי ייצור31,32,33, נדגים בעיתון הזה שזה שימושי במיוחד עבור הדור של המתוסבכים מיסודה, חלבון amyloidogenic נוטה צבירה, כגון Httex1. אנו מאמינים כי פשטות, יעילות ועמידות בשיטה שלנו סומו-פיוז’ן מבוססי להפוך Httex1 מקורי, ללא תג יותר נגיש חוקרים מדיסציפלינות שונות מסלק את הצורך להשתמש שנוצרה רצפים של Httex1 במבחנה . זה מקדמה חשובה זה יקל על מחקרים עתידיים להבהיר את הקשר מבנה פונקציה של Httex1.
הפרוטוקול מתאר הטיהור של Httex1 מ L 12 של התרבות חיידקי, אך הפרוטוקול יכול להתאים בקלות להפקות בקנה מידה קטן או גדול יותר. הפרוטוקול מתאר את הייצור של פראי סוג Httex1 (wtHttex1) עם polyQ אני חוזר אורך מתחת (23Q), מוטציה Httex1 (mHttex1) עם polyQ חוזר אורך לעיל (43Q) הסף פתוגניים (36Q).
ב פרוטוקול זה, אנחנו המחולקות הליך יעיל עבור להשיג כמויות מיליגרם של מקורי, לא מתויגות Httex1 המכילים שאריות גלוטמין 23 או 43. דבר זה הושג על ידי הבעת Httex1 כמו פיוז’ן C-מסוף כדי שלו6-סומו תג, אשר משמש כדי לבודד את חלבון כימרי מהתא lysate על ידי ה-IMAC הוא ביקע לפני טיהור HPLC של Httex1. ואילו האסטרטגיה סומו שימש בייצור של מספר חלבונים אחרים, השיטה שלנו מראה כי תכונותיו הייחודיות שסומו יכול לשמש גם כדי ליצור ממהותם מגרה, צבירת-מועדים, חלבון amyloidogenic הוכחו בעבר קשה מאוד לטפל ולהפיק43,44. אנו מציגים פרוטוקול זה פשוט, קל לשימוש, להשוות פרוטוקול לדור של חלבון “נאותה”. פיוז’ן סומו solubilizes ומייצב Httex1 במהלך השלב טיהור IMAC וביטוי. פצילות מוקדמת של התג, כפי שנצפה עם אסטרטגיה intein10 , צבירת היו כבר לא בעיה.
חלבונים ממהותם המתוסבכים פגיעים במיוחד השפלה. בעוד N-מסוף השפלה באזור N17 אינה בעיה באמצעות פרוטוקול זה, truncations של ההקלטה של Httex1 יכול להתרחש. החלבונים קטום דומים מאוד Httex1 hydrophobicity, תשלום, בגודל, הסרתם באמצעים כרומטוגרפי הוא מאתגר, ולכן עדיף למנוע היווצרות שלהם מלכתחילה. נצמדים היטב הפרוטוקול, תמיד עובד על הקרח ושימוש כמות מספקת של מעכבי פרוטאז אמור לעזור לשמור על הרמה של החיתוך שנצפה נמוך מאוד. החלת תג פיוז’ן ב C-הסופית של Httex1 יכול להסיר truncations ההקלטה בקלות כמו החלבון קטום יפסיד תג קירבה. עם זאת, אם הרצף המקורי צריך להיות מתוחזק שאין אפשרות להחיל את אפשרות זו כפי Httex1 מסתיים עם פרולין, לפי מיטב ידיעתנו ישנם אין תגיות פיוז’ן C-מסוף ידועים לזירוז פצילות traceless ויעילה לאחר פרולין.
החלק הקריטי ביותר של הפרוטוקול הוא טיפול Httex1 משוחררת לאחר המחשוף של התג סומו ע י ULP1. החלבון צריך להיטהר באופן מיידי על-ידי RP-HPLC. למרבה המזל, זה לתגובה, מהיר ויעיל, בדרך כלל שהושלמו ב- 10-20 דקות ב 4 º C. לעומת זאת, האסטרטגיה intein נדרש מספר שעות למחשוף מלאה של intein, וכך מצריכים פשרה בין תחילת צבירת המחשוף לא שלם על מנת למקסם את התשואה. בדיקה מהירה נדרשת עבור מוטציה Httex1, כמו זה יהיה להתחיל לצבור על הריכוז הגבוה יחסית נוכח התגובה המחשוף, ואילו הגרסה 23Q יציב למשך זמן ארוך יותר. במהלך הטיהור RP HPLC, יתרון נוסף של סומו הופך לכאורה: בעוד intein DnaB Ssp דוחה מים נדבק בחריפות העמודה, סומו הוא יותר הידרופיליות, elutes לחלוטין מן העמודה הפוך-פאזי C4. ULP1 מסחרי אמנם קצת יותר יקר, החלבון יכול להיות בקלות מיוצר תשואה גבוהה בעקבות פרוטוקולים שפורסמו בעבר29.
חשיבות קריטית החלת נוהל disaggregation לפני שימוש Httex1 לא יכול להיות מתוח מספיק. Lyophilized polyQ חלבונים כגון Httex1 יציבים, יכולים להיות מאוחסנים תקופות ארוכות, אך אינם לגמרי מסיסי מים, מאגרי. הנוכחות של preformed oligomers או הסיבים יכול להיות השפעה משמעותית על צבירת קינטיקה ומאפיינים ביופיזיקלי חלבון45. פרוטוקול disaggregation המתוארים כאן מאפשר את disaggregation של החלבון, הסרה של אגרגטים preformed, דור של פתרון של Httex1 monomeric מתוך מדגם lyophilized. הבחנו מורפולוגיה קינטיקה, fibril צבירת דומה עבור Httex1 שהושג עם בגלל הסומו ואסטרטגיה intein.
לעומת שיטות קודמות לייצור Httex1, האסטרטגיה סומו המתוארים כאן מציעה מספר יתרונות, מרחיבה את מגוון מחקרים ניתן לחקור את מבנה ומאפייני פונקציונלי של חלבון זה על בריאות ומחלה. החלבון פיוז’ן סומו-Httex1 קל לטפל, שניתן יהיה קפוא, לאחסן או שמרו על פתרון עבור 24 שעות בטמפרטורת החדר, בעוד mHttex1 חינם צבירה במהירות. יציבות, המסיסות גבוהה החלבונים פיוז’ן סומו-Httex1 מספקים גמישות רבה יותר לתמרן החלבון ו/או להציג את השינויים אנזימטי והכימיות לתוך mHttex1 שאחרת לא היה אפשרי לאחר המחשוף. זה כולל המבוא של שינויים post-translational, fluorophores, ספין תוויות, ביוטין תגיות, וכו ‘ ההתקדמות המובאת כאן צריך 1) לקדם מחקרים עתידיים התירי קשרי גומלין מבנה פונקציה של Httex1; 2) ליצור כלים חדשים לחקור Htt צבירת והפצת פתולוגיה; 3) לאפשר הפיתוח של מבחני חדש לזיהוי מולקולות לייצב את המוטציה Httex1 ולמנוע צבירת שלה; . ו-4) לעודד מדענים מתחומים אחרים להביא לעבוד על חלבון זה ולהצטרף החיפוש שלנו כדי למצוא תרופות עבור מחלת הנטינגטון.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו מומן בעיקר על ידי מענקים קרן CHDI, הקרן הלאומית למדע שוויצרי. אנו מודים ד ר סופי Vieweg לדיונים שימושי במהלך הפיתוח של מערכת חדשה זו הביטוי ואת שאר חברי הקבוצה Lashuel לשיתוף ניסיונם עם מערכת זו ביטוי ועל המשוב שלהם קלט ובעל ערך. אנו מודים גם פרופסור אוליבר Hantschel עבור מספקים את פלסמיד ULP1. המחברים תודה ד ר ג’ון B. וורנר, ד ר יצחק ק’ Thangaraj על סקירה ביקורתית של כתב היד
Uranyl formate (UO2(CHO2)2) | EMS | 22450 | |
Formvar/carbon 200 mesh, Cu 50 grids | EMS | FCF200-Cu-50 | |
High Precision Cell made of Quartz SUPRASIL 1 mm light path from Hellma Analytics | HellmaAnalytics | 110-1-40 | |
Buffer Substance Dulbecco's (PBS w/o Ca and Mg) ancinne ref 47302 (RT) SERVA | Witech | SVA4730203 | |
Ampicillin | AxonLab | A0839.0100 | |
Luria Broth (Miller's LB Broth) | Chemie Brunschwig | 1551.05 | |
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | AxonLab | A1008.0025 | |
E. coli B ER2566 | NEB | NEB# E4130 | |
Imidazole | Sigma | 56750-500G | |
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693116001 | |
Anti-Huntingtin Antibody, a.a. 1-82 | Merck Millipore Corporation | MAB5492 | |
IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG (H + L) | Licor | 925-68070 | |
PMSF | AxonLab | A0999.0005 | |
HisPrep 16/10 column | GE Healthcare | 28936551 | |
C4 HPLC column | Phenomenex | 00G-4168.P0 | 10 µm C4 300 Å, LC Column 250 x 21.2 mm, Phenomenex, 19×10 mm guard column, not temperature jacketed |
Acetonitrile HPLC | MachereyNagel | C2502 | |
Filtre seringue Filtropur S 0,45 ul sans prefiltre sterile | Sarstedt AG | 83.1826 | |
Spectrophotometer semi-micro cuvette | Reactolab S.A. | 2534 | |
Superloop, 1/16" fittings (ÄKTAdesign), 50 ml | GE Healthcare | 18111382 | |
Trifluoroacetic acid | Sigma | 302031 | |
GREINER Tubes fo FPLC 16 x 100 mm, cap. 12.0 ml | Greiner Bio-One | 7.160 102 | |
100 kD Microcon fast flow filters | Merck Millipore Corporation | MRCF0R100 | |
Vibra-cell VCX130 ultrasonic liquid processor | Sonics | ||
Äkta 900 equipped with a fraction collector | GE Healthcare | ||
Jasco J-815 Circular Dichroism | Jasco | ||
Waters UPLC system | Waters | C8 BEH acquity 2.1×100 mm 1.7 micron column , preheated column (40 °C), flow rate of 0.6 mL/min, injection volume of 4 μL | |
waters HPLC system | Waters | 2489 UV detector and 2535 quaternary gradient module, 20 mL loop in a FlexInject housing | |
ESI-MS: Finnigan LTQ | Thermo Fisher Scientific | ||
lyophylizer instrument | FreeZone 2.5 Plus | ||
Tecnai Spirit BioTWIN | FEI | electron microscope equipped with a LaB6 gun and a 4K x 4K FEI Eagle CCD camera (FEI) and operated at 80 kV | |
37 °C shaking incubator | Infors HT multitron Standard | ||
Biophotometer plus | Eppendorf |