صنع واختبار واستخدام البوتاسيوم أيون ميكروليكتروديس انتقائية في شرائح أنسجة الدماغ الكبار
Summary
أيونات البوتاسيوم تساهم يستريح إمكانات غشاء الخلايا والخلية ك+ تركيز منظم حاسمة لاستثارة الخلوية. ونحن تصف كيفية جعل ومعايرة واستخدام أحادي القطب ك+-ميكروليكتروديس انتقائية. استخدام هذه الأقطاب يتيح قياس ديناميات تركيز ك+ مقولة كهربائياً في شرائح هيبوكامبال الكبار.
Abstract
أيونات البوتاسيوم تساهم مساهمة كبيرة في إمكانات غشاء يستريح من الخلايا، وذلك، خارج الخلية ك+ تركيز منظم حاسمة لاستثارة الخلية. تغيير تركيزات من خارج الخلية ك+ يؤثر على استثارة الغشاء يستريح المحتملة والخلوية بالتحول في التوازنات بين الدول المغلقة والمفتوحة والمعطل لقنوات أيون تعتمد على الجهد التي تكمن وراء إمكانات العمل بدء والتوصيل. ومن ثم فإنها ذات قيمة لقياس ديناميات ك+ خارج الخلية في الصحة والدول المريضة مباشرة. هنا، نحن تصف كيفية جعل ومعايرة واستخدام أحادي القطب ك+-ميكروليكتروديس انتقائية. قمنا بنشر لهم في شرائح المخ هيبوكامبال الكبار لقياس ديناميات تركيز ك+ مقولة كهربائياً. الاستخدام الحكيم لهذه الأقطاب هو جزء مهم من مجموعة الأدوات اللازمة لتقييم الآليات الخلوية والفيزيائية التي تتحكم في تركيزات ك+ خارج الخلية في الجهاز العصبي.
Introduction
أحكام تنظم تركيزات أيون البوتاسيوم في الدماغ، وتقلباتها له تأثير قوي على إمكانات غشاء يستريح كافة الخلايا. وفي ضوء هذه الإسهامات الحاسمة، هو هدفا هاما لعلم الأحياء تحديد الآليات الخلوية والفيزيائية الحيوية التي يتم استخدامها لتنظيم محكم تركيز ك+ في الفضاء خارج الخلية في الأجهزة المختلفة ل الجسم1 , 2-شرط هام في هذه الدراسات هو القدرة على قياس تركيزات ك+ بدقة. على الرغم من أن العديد من العناصر التي تسهم في التوازن البوتاسيوم في الدماغ في الدول السليمة والمريضة قد حددت3،،من45، تباطأ التقدم كذلك بسبب الطبيعة المتخصصة إعداد أيون ميكروليكتروديس الانتقائي لقياس البوتاسيوم. أجهزة الاستشعار ميكروليكترودي تمثل المعيار الذهبي لقياس ك+ التركيزات في المختبر، في شرائح الأنسجة و في فيفو.
أحدث النهج ك+ الرصد هي قيد التطوير باستخدام أجهزة الاستشعار البصرية، بيد أن هذه لا يكشف تركيزات البيولوجية ذات الصلة لمجموعة ك+ أو قد لا تم تماما وفحص في النظم البيولوجية، على الرغم من أن النتائج الأولية تبدو واعدة6،،من78. مقارنة بأجهزة الاستشعار البصرية، ميكروليكتروديس محدودة أساسا لقياس نقطة مصدر الأيونات، على الرغم من صفائف القطب يمكن تحسين القرار المكانية9. تركز هذه المقالة على ماسورة واحدة ميكروليكترودي أجهزة الاستشعار لرصد ديناميات ك+ .
في هذا العمل، نحن تقرير مفصل إجراءات التدرجي لجعل ك+ ميكروليكتروديس انتقائية، باستخدام ionophore بوتاسيوم المستندة إلى فالينوميسين التي تسمح بانتقائية للغاية (104 إضعاف ك+ إلى الانتقائية نا+ ) ك+ الحركة عبر أغشية10. ببتيد طبيعيا، فالينوميسين بمثابة مسام نفاذية ك+ وييسر تدفق ك+ إلى أسفل التدرج اللوني الكهروكيميائية. ونحن أيضا وصف كيفية معايرة الأقطاب، كيفية تخزينها واستخدامها، وأخيراً كيفية نشرها لقياس ديناميات تركيز ك+ في شرائح المخ هيبوكامبال الحاد من الفئران الكبار. استخدام أقطاب هذه جنبا إلى جنب مع الفئران المعدلة وراثيا التي تفتقر إلى قنوات أيون المحددة المقترحة لتنظيم خارج الخلية ك+ حيوية ينبغي أن تكشف عن الآليات الخلوية المستخدمة من قبل الجهاز العصبي للتحكم بتركيز ك المحيطة + في الوسط خارج الخلية.
Protocol
Representative Results
Discussion
الأسلوب الذي يصف لنا هنا قد سمح لنا تقييم ديناميات ك+ استجابة للتحفيز الكهربائي للضمانات شافر في شرائح هيبوكامبال الحاد من الفئران الكبار. لدينا طريقة لإعداد ك+ ميكروليكتروديس أيون انتقائية مماثلة للإجراءات الموصوفة في وقت سابق12،13،،</s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد المختبر كاخ MH104069 المعاهد الوطنية للصحة. مختبر مودي أيده NS030549 المعاهد الوطنية للصحة. بفضل J.C.O. Grant(NS058280) التدريب رقائق العصبية في المعاهد الوطنية للصحة T32.
Materials
| Vibratome | DSK | Microslicer Zero 1 | |
| Mouse: C57BL/6NTac inbred mice | Taconic | Stock#B6 | |
| Microscope | Olympus | BX51 | |
| Electrode puller | Sutter | P-97 | |
| Ag/AgCl ground pellet | WPI | EP2 | |
| pCLAMP10.3 | Molecular Devices | n/a | |
| Custom microfil 28G tip | World precision instruments | CMF28G | |
| Tungsten Rod | A-M Systems | 716000 | |
| Bipolar stimulating electrodes | FHC | MX21XEW(T01) | |
| Stimulus isolator | World precision instruments | A365 | |
| Grass S88 Stimulator | Grass Instruments Company | S88 | |
| Borosilicate glass pipettes | World precision instruments | 1B150-4 | |
| A to D board | Digidata 1322A | Axon Instruments | |
| Signal Amplifier | Multiclamp 700A or 700B | Axon Instruments | |
| Headstage | CV-7B Cat 1 | Axon Instruments | |
| Patch computer | Dell | n/a | |
| Sodium Chloride | Sigma | S5886 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P3911 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S0751 | |
| D-glucose | Sigma | G7528 | |
| Calcium Chloride | Sigma | 21108 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | |
| valinomycin | Sigma | V0627-10mg | |
| 1,2-dimethyl-3-nitrobenzene | Sigma | 40870-25ml | |
| Potassium tetrakis (4-chlorophenyl)borate | Sigma | 60591-100mg | |
| 5% dimethyldichlorosilane in heptane | Sigma | 85126-5ml | |
| TTX | Cayman Chemical Company | 14964 | |
| Hydrochloric acid | Sigma | H1758-500mL | |
| Sucrose | Sigma | S9378-5kg | |
| Pipette Micromanipulator | Sutter | MP-285 / ROE-200 / MPC-200 | |
| Objective lens | Olympus | PlanAPO 10xW |
References
- McDonough, A. A., Youn, J. H. Potassium homeostasis: The knowns, the unknowns, and the health benefits. Physiol Bethesda Md. 32 (2), 100-111 (2017).
- Hille, B. . Ion channels of excitable membranes. , 507 (2001).
- Kofuji, P., Ceelen, P., Zahs, K. R., Surbeck, L. W., Lester, H. A., Newman, E. A. Genetic inactivation of an inwardly rectifying potassium channel (Kir4.1 subunit) in mice: Phenotypic impact in retina. J Neurosci. 20 (15), 5733-5740 (2000).
- Sibille, J., Dao Duc, K., Holcman, D., Rouach, N. The neuroglial potassium cycle during neurotransmission: role of Kir4.1 channels. PLoS Comput Biol. 11 (3), e1004137 (2015).
- Tong, X., et al. Astrocyte Kir4.1 ion channel deficits contribute to neuronal dysfunction in Huntington’s disease model mice. Nat Neurosci. 17 (5), 694-703 (2014).
- Datta, D., Sarkar, K., Mukherjee, S., Meshik, X., Stroscio, M. A., Dutta, M. Graphene oxide and DNA aptamer based sub-nanomolar potassium detecting optical nanosensor. Nanotechnology. 28 (32), 325502 (2017).
- Bandara, H. M. D., et al. Palladium-Mediated Synthesis of a Near-Infrared Fluorescent K+ Sensor. J Org Chem. 82 (15), 8199-8205 (2017).
- Depauw, A., et al. A highly selective potassium sensor for the detection of potassium in living tissues. Chem Weinh Bergstr Ger. 22 (42), 14902-14911 (2016).
- Machado, R., et al. Biofouling-Resistant Impedimetric Sensor for Array High-Resolution Extracellular Potassium Monitoring in the Brain. Biosensors. 6 (4), (2016).
- Rose, M. C., Henkens, R. W. Stability of sodium and potassium complexes of valinomycin. Biochim Biophys Acta BBA – Gen Subj. 372 (2), 426-435 (1974).
- Ammann, D., Chao, P., Simon, W. Valinomycin-based K+ selective microelectrodes with low electrical membrane resistance. Neurosci Lett. 74 (2), 221-226 (1987).
- Amzica, F., Steriade, M. Neuronal and glial membrane potentials during sleep and paroxysmal oscillations in the neocortex. J Neurosci. 20 (17), 6648-6665 (2000).
- Amzica, F., Steriade, M. The functional significance of K-complexes. Sleep Med Rev. 6 (2), 139-149 (2002).
- MacVicar, B. A., Feighan, D., Brown, A., Ransom, B. Intrinsic optical signals in the rat optic nerve: role for K(+) uptake via NKCC1 and swelling of astrocytes. Glia. 37 (2), 114-123 (2002).
- Chever, O., Djukic, B., McCarthy, K. D., Amzica, F. Implication of Kir4.1 channel in excess potassium clearance: an in vivo study on anesthetized glial-conditional Kir4.1 knock-out mice. J Neurosci. 30 (47), 15769-15777 (2010).
- Hall, D. G. Ion-selective membrane electrodes: A general limiting treatment of interference effects. J Phys Chem. 100 (17), 7230-7236 (1996).
- Haack, N., Durry, S., Kafitz, K. W., Chesler, M., Rose, C. R. Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue. J Vis Exp. (103), e53058 (2015).
- Larsen, B. R., MacAulay, N. Kir4.1-mediated spatial buffering of K(+): Experimental challenges in determination of its temporal and quantitative contribution to K(+) clearance in the brain. Channels Austin Tex. 8 (6), 544-550 (2014).
- Mei, L., et al. Long-term in vivo recording of circadian rhythms in brains of freely moving mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, 4276-4281 (2018).
