बनाने, परीक्षण, और वयस्क मस्तिष्क के ऊतक स्लाइस में पोटेशियम आयन चयनात्मक Microelectrodes का उपयोग
Summary
पोटेशियम आयनों कोशिकाओं की शेष झिल्ली क्षमता में योगदान और extracellular K+ एकाग्रता सेलुलर उत्तेजितता का एक महत्वपूर्ण नियामक है । हम का वर्णन कैसे बनाने के लिए, जांचना और monopolar K+-चयनात्मक microelectrodes का उपयोग करें । ऐसे इलेक्ट्रोड का उपयोग वयस्क हिप्पोकैम्पस स्लाइस में विद्युत पैदा की+ एकाग्रता गतिशीलता के माप को सक्षम बनाता है.
Abstract
पोटेशियम आयनों काफी कोशिकाओं के आराम झिल्ली क्षमता में योगदान और, इसलिए, extracellular K+ एकाग्रता सेल उत्तेजितता का एक महत्वपूर्ण नियामक है । extracellular K की बदल सांद्रता+ वोल्टेज पर निर्भर आयन चैनलों के लिए बंद, खुला और निष्क्रिय राज्यों के बीच equilibria स्थानांतरण द्वारा आराम झिल्ली क्षमता और सेलुलर उत्तेजितता को प्रभावित करता है कि आबाद कार्रवाई की क्षमता दीक्षा और आचरण । इसलिए, यह सीधे स्वास्थ्य और रोगग्रस्त राज्यों में extracellular K+ गतिशीलता को मापने के लिए मूल्यवान है । यहां, हम का वर्णन कैसे बनाने के लिए, जांचना और उपयोग monopolar K+-चयनात्मक microelectrodes । हम उंहें वयस्क हिप्पोकैम्पस मस्तिष्क स्लाइस में तैनात को मापने के लिए बिजली पैदा की कश्मीर+ एकाग्रता गतिशीलता । इस तरह के इलेक्ट्रोड के विवेकपूर्ण उपयोग उपकरण के लिए सेलुलर और भौतिक तंत्र का मूल्यांकन है कि तंत्रिका तंत्र में extracellular K+ सांद्रता नियंत्रण की जरूरत किट का एक महत्वपूर्ण हिस्सा है ।
Introduction
पोटेशियम आयन सांद्रता कसकर मस्तिष्क में विनियमित रहे हैं, और उनके उतार चढ़ाव सभी कोशिकाओं के आराम झिल्ली क्षमता पर एक शक्तिशाली प्रभाव डालती. इन महत्वपूर्ण योगदान के प्रकाश में, जीव विज्ञान का एक महत्वपूर्ण लक्ष्य के लिए सेलुलर और जैव शारीरिक तंत्र है कि कसकर के लिए उपयोग किया जाता है निर्धारित करने के लिए है K+ शरीर के विभिन्न अंगों में extracellular अंतरिक्ष में1 की एकाग्रता को विनियमित , 2. इन अध्ययनों में एक महत्वपूर्ण आवश्यकता है K+ सांद्रता को सही तरीके से मापने की क्षमता. हालांकि कई घटक जो स्वस्थ और रोगग्रस्त राज्यों में मस्तिष्क में पोटेशियम homeostasis के लिए योगदान की पहचान की गई है3,4,5, आगे की प्रगति के विशेष प्रकृति के कारण धीमा कर दिया गया है पोटेशियम माप के लिए आयन चयनात्मक microelectrodes की तैयारी. Microelectrode सेंसर इन विट्रो में+ सांद्रता, ऊतक स्लाइस में और vivo मेंमापने के लिए सोने के मानक का प्रतिनिधित्व करते हैं ।
कश्मीर+ निगरानी के लिए नए दृष्टिकोण विकास ऑप्टिकल सेंसर का उपयोग कर के तहत कर रहे हैं, लेकिन इन k+ सांद्रता के एक जैविक रूप से प्रासंगिक रेंज का पता नहीं है या पूरी तरह से जैव प्रणालियों में संचालित नहीं किया गया है, हालांकि प्रारंभिक परिणाम 6,7,8होनहार दिखाई देते हैं । ऑप्टिकल सेंसर की तुलना में, microelectrodes आयनों के एक बिंदु स्रोत माप करने के लिए मौलिक रूप से सीमित हैं, हालांकि इलेक्ट्रोड arrays स्थानिक संकल्प9सुधार कर सकता है । यह लेख K+ गतिशीलता की निगरानी के लिए एकल-बैरलेड microelectrode सेंसर पर केंद्रित है ।
इस काम में, हम विस्तृत stepwise प्रक्रियाओं की रिपोर्ट k+ चयनात्मक microelectrodes बनाने के लिए, एक valinomycin-आधारित पोटेशियम ionophore का उपयोग कर कि परमिट उच्च चयनात्मक (104 गुना k+ to एनए+ selectivity) k+ 10झिल्ली पर आंदोलन । एक स्वाभाविक रूप से होने वाली पॉलीपेप्टाइड, valinomycin एक k+ पारगंय ताकना के रूप में कार्य करता है और कश्मीर के प्रवाह की सुविधा+ नीचे यह विद्युत ढाल है । हम यह भी वर्णन कैसे इलेक्ट्रोड जांच करने के लिए कैसे, दुकान और उन्हें का उपयोग करने के लिए कैसे और अंत में वयस्क चूहों से तीव्र हिप्पोकैम्पस मस्तिष्क स्लाइस में K+ एकाग्रता गतिशीलता उपाय करने के लिए उन्हें तैनात करने के लिए कैसे. आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों के साथ एक साथ ऐसे इलेक्ट्रोड का उपयोग करें कि extracellular k+ गतिशीलता को विनियमित करने के लिए प्रस्तावित विशिष्ट आयन चैनलों का अभाव सेलुलर तंत्र से पता चलता है कि कश्मीर के परिवेश एकाग्रता को नियंत्रित करने के लिए तंत्रिका तंत्र द्वारा इस्तेमाल किया जाना चाहिए + extracellular वातावरण में ।
Protocol
Representative Results
Discussion
विधि है कि हम यहां का वर्णन हमें वयस्क चूहों से तीव्र हिप्पोकैम्पस स्लाइस में Schaffer जमानतों की विद्युत उत्तेजना के जवाब में कश्मीर की गतिशीलता का आकलन करने की अनुमति दी है । K+ आयन चयनात्मक microelectrodes त…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
खाख लैब को NIH MH104069 ने सपोर्ट किया था । मॉडि लैब को NIH NS030549 ने सपोर्ट किया था । J.C.O. धन्यवाद NIH T32 तंत्रिका Microcircuits प्रशिक्षण अनुदान (NS058280) ।
Materials
| Vibratome | DSK | Microslicer Zero 1 | |
| Mouse: C57BL/6NTac inbred mice | Taconic | Stock#B6 | |
| Microscope | Olympus | BX51 | |
| Electrode puller | Sutter | P-97 | |
| Ag/AgCl ground pellet | WPI | EP2 | |
| pCLAMP10.3 | Molecular Devices | n/a | |
| Custom microfil 28G tip | World precision instruments | CMF28G | |
| Tungsten Rod | A-M Systems | 716000 | |
| Bipolar stimulating electrodes | FHC | MX21XEW(T01) | |
| Stimulus isolator | World precision instruments | A365 | |
| Grass S88 Stimulator | Grass Instruments Company | S88 | |
| Borosilicate glass pipettes | World precision instruments | 1B150-4 | |
| A to D board | Digidata 1322A | Axon Instruments | |
| Signal Amplifier | Multiclamp 700A or 700B | Axon Instruments | |
| Headstage | CV-7B Cat 1 | Axon Instruments | |
| Patch computer | Dell | n/a | |
| Sodium Chloride | Sigma | S5886 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P3911 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S0751 | |
| D-glucose | Sigma | G7528 | |
| Calcium Chloride | Sigma | 21108 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | |
| valinomycin | Sigma | V0627-10mg | |
| 1,2-dimethyl-3-nitrobenzene | Sigma | 40870-25ml | |
| Potassium tetrakis (4-chlorophenyl)borate | Sigma | 60591-100mg | |
| 5% dimethyldichlorosilane in heptane | Sigma | 85126-5ml | |
| TTX | Cayman Chemical Company | 14964 | |
| Hydrochloric acid | Sigma | H1758-500mL | |
| Sucrose | Sigma | S9378-5kg | |
| Pipette Micromanipulator | Sutter | MP-285 / ROE-200 / MPC-200 | |
| Objective lens | Olympus | PlanAPO 10xW |
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