成人脑组织切片中钾离子选择性电极的制备、检测及应用
Summary
钾离子有助于细胞的静止膜电位, 胞外 K+浓度是细胞兴奋性的重要调节因子。我们描述如何制作, 校准和使用单 K+选择性电极。使用此类电极可以测量成年海马切片中电诱发的 K+浓度动态。
Abstract
钾离子对细胞的静止膜电位有显著的促进作用, 因此胞外 K+浓度是细胞兴奋性的重要调节因子。细胞外 K+的浓度改变会影响静止膜电位和细胞兴奋性, 方法是将闭合的、开放的和灭活状态之间的平衡转移到有作用电位的电压依赖离子通道上。启动和传导。因此, 直接测量健康和患病状态下的胞外 K+动态是很有价值的。在这里, 我们描述如何制作, 校准和使用单 K+选择性电极。我们将它们部署在成人海马脑切片中, 以测量电诱发 K+浓度动态。明智地使用此类电极是评估细胞和生物物理机制, 以控制神经系统细胞外 K+浓度所需的工具套件的重要组成部分。
Introduction
钾离子浓度在大脑中受到严格的调节, 它们的波动对所有细胞的静止膜电位有很大的影响。根据这些重要的贡献, 生物学的一个重要目标是确定细胞和生物物理机制, 用于在身体的不同器官的细胞外空间中严格调节 K+的浓度1,2. 这些研究的一个重要要求是能够准确地测量 K+浓度。虽然在健康和患病状态下, 许多有助于大脑中钾稳态的成分已经被确认为3,45, 由于专业性质的原因, 进一步的进展已经减慢。制备离子选择性电极钾的方法。微电极传感器表示用于测量 K+浓度体外、组织切片和体内中的金标准。
用于 k+监视的更新方法正在使用光学传感器进行开发, 但这些检测不到与生物学相关的 k+浓度范围, 也未在生物系统中进行全面审查, 尽管初步结果显示有希望的6,7,8。与光学传感器相比, 电极从根本上被限制为离子的点源测量, 虽然电极阵列可以改善空间分辨率9。本文重点介绍了用于监测 K+动力学的单桶微电极传感器。
在这项工作中, 我们报告详细的逐步过程, 使 K+选择性电极, 使用基于 valinomycin 的钾载体, 允许高度选择性 (104折叠 k+到 Na+选择性) k+在膜上运动10。valinomycin 是一种自然发生的多肽, 它充当 k+渗透性孔隙, 并使 k+的流量降低到其电化学梯度。我们还描述了如何校准电极, 如何存储和使用它们, 最后如何部署它们来测量成年小鼠海马脑切片中的 K+浓度动态。使用此类电极和基因修饰小鼠缺乏特定的离子通道来调节胞外 K+动力学应该揭示神经系统使用的细胞机制来控制 k 的环境浓度。在胞外环境中的+ 。
Protocol
所有动物实验都是按照美国国家卫生研究院的实验室动物护理和使用指南进行的, 并得到了加州大学洛杉矶分校校长动物研究委员会的批准。所有的老鼠都是在12小时的昏暗环境中使用食物和水的ad 随意。所有动物都是健康的, 没有明显的行为变化, 没有参与以前的研究, 并在光周期中牺牲。实验数据从成年小鼠 (6-8 周大的所有实验) 中采集。 1. K+选择性电极的制备…
Representative Results
对于细胞外 K+的选择性测量, 我们通过硅烷化清洁硼硅酸盐玻璃吸管(图 1A), 制备了具有疏水性层的离子选择性电极。此涂层使包含 valinomycin 的 k+载体在电极尖端上休息, 并且仅允许 k+通量通过在电极尖端的窄开口 (图 1B)。在用回填盐水溶液和 K+载体启动电极后, 可以对电极进行测试, 使其快速、?…
Discussion
我们在这里描述的方法使我们能够评估 K+动力学, 以响应电刺激的谢弗络在急性海马切片的成年小鼠。我们准备 K+离子选择性电极的方法类似于前面描述的过程12,13,14,15。然而, 这种方法优于替代电极配置, 因为它是快速和复杂的准备 K+选择性电极。在适当的校准后, 发现这些电…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Khakh 实验室得到了 NIH MH104069 的支持。这个实验室是由 NIH NS030549 支持的。J.C.O. 感谢 NIH T32 神经集成电路训练补助金 (NS058280)。
Materials
| Vibratome | DSK | Microslicer Zero 1 | |
| Mouse: C57BL/6NTac inbred mice | Taconic | Stock#B6 | |
| Microscope | Olympus | BX51 | |
| Electrode puller | Sutter | P-97 | |
| Ag/AgCl ground pellet | WPI | EP2 | |
| pCLAMP10.3 | Molecular Devices | n/a | |
| Custom microfil 28G tip | World precision instruments | CMF28G | |
| Tungsten Rod | A-M Systems | 716000 | |
| Bipolar stimulating electrodes | FHC | MX21XEW(T01) | |
| Stimulus isolator | World precision instruments | A365 | |
| Grass S88 Stimulator | Grass Instruments Company | S88 | |
| Borosilicate glass pipettes | World precision instruments | 1B150-4 | |
| A to D board | Digidata 1322A | Axon Instruments | |
| Signal Amplifier | Multiclamp 700A or 700B | Axon Instruments | |
| Headstage | CV-7B Cat 1 | Axon Instruments | |
| Patch computer | Dell | n/a | |
| Sodium Chloride | Sigma | S5886 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P3911 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S0751 | |
| D-glucose | Sigma | G7528 | |
| Calcium Chloride | Sigma | 21108 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | |
| valinomycin | Sigma | V0627-10mg | |
| 1,2-dimethyl-3-nitrobenzene | Sigma | 40870-25ml | |
| Potassium tetrakis (4-chlorophenyl)borate | Sigma | 60591-100mg | |
| 5% dimethyldichlorosilane in heptane | Sigma | 85126-5ml | |
| TTX | Cayman Chemical Company | 14964 | |
| Hydrochloric acid | Sigma | H1758-500mL | |
| Sucrose | Sigma | S9378-5kg | |
| Pipette Micromanipulator | Sutter | MP-285 / ROE-200 / MPC-200 | |
| Objective lens | Olympus | PlanAPO 10xW |
References
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Cite This Article
Octeau, J. C., Faas, G., Mody, I., Khakh, B. S. Making, Testing, and Using Potassium Ion Selective Microelectrodes in Tissue Slices of Adult Brain. J. Vis. Exp. (135), e57511, doi:10.3791/57511 (2018).