Facendo, test e l'utilizzo di microelettrodi selettivo di ioni potassio in fettine di tessuto del cervello adulto
Summary
Gli ioni del potassio contribuiscono per il potenziale di membrana di riposo delle cellule e concentrazione extracellulare di K+ è un regolatore fondamentale dell’eccitabilità cellulare. Descriviamo come fare, calibrare e utilizzare monopolare K+-selettivi microelettrodi. Utilizzando tali elettrodi consente la misurazione delle dinamiche di concentrazione K+ elettricamente evocate nelle fette hippocampal adulti.
Abstract
Gli ioni potassio contribuiscono in modo significativo per il potenziale di membrana di riposo delle cellule e, di conseguenza, la concentrazione extracellulare di K+ è un regolatore cruciale dell’eccitabilità delle cellule. Alterato le concentrazioni extracellulari di K+ effetto l’eccitabilità cellulare e potenziali di membrana riposo spostando gli equilibri tra stati chiusi, aperti e inattivati per canali ionici voltaggio-dipendenti che sono alla base di potenziale di azione Iniziazione e conduzione. Quindi, è prezioso per misurare direttamente extracellulare K+ dinamiche in salute e stati malati. Qui, descriviamo come fare, calibrare e utilizzare monopolare K+-selettivi microelettrodi. Li abbiamo distribuito in fette di cervello hippocampal adulto per misurare elettricamente evocate K+ concentrazione dinamica. L’uso giudizioso di tali elettrodi è una parte importante di tool-kit necessari per valutare i meccanismi biofisici e cellulari che controllano le concentrazioni extracellulari di K+ nel sistema nervoso.
Introduction
Concentrazioni di ioni di potassio sono strettamente regolati nel cervello, e le loro fluttuazioni esercitano una potente influenza sul potenziale di membrana di riposo di tutte le cellule. Alla luce di questi contributi critici, un obiettivo importante di biologia è determinare i meccanismi biofisici e cellulari che vengono utilizzati per regolare strettamente la concentrazione di K+ nello spazio extracellulare in vari organi del corpo1 , 2. un requisito importante in questi studi è la capacità di misurare le concentrazioni di K+ con precisione. Anche se molti componenti che contribuiscono all’omeostasi del potassio nel cervello negli stati sani e malati sono stati identificati3,4,5, ulteriori progressi sono stato rallentato a causa della natura specialistica preparazione di microelettrodi selettiva dello ione per la misura di potassio. Microelettrodo sensori rappresentano il gold standard per la misurazione di K+ le concentrazioni in vitro, in fettine di tessuto e in vivo.
Approcci più recenti per K+ monitoraggio sono in fase di sviluppo mediante sensori ottici, tuttavia questi non rilevano un concentrazioni biologicamente rilevanti gamma di K+ o non siano stati completamente controllati nei sistemi biologici, anche se i risultati iniziali appaiono promettenti6,7,8. Rispetto ai sensori ottici, microelettrodi sono fondamentalmente limitati ad un punto sorgente di ioni, anche se l’array di elettrodi potrebbe migliorare la risoluzione spaziale di9. Questo articolo si concentra sui sensori del microelettrodo singolo-canna per monitoraggio K+ dynamics.
In questo lavoro, segnaliamo procedure dettagliate graduale di rendere K+ microelettrodi selettivi, utilizzando un ionoforo potassio valinomicina-basato che permette altamente selettivo (104 piega alla selettività Na+ K+ ) K+ movimento su membrane10. Un polipeptide natura, valinomicina agisce come un poro permeabile K+ e facilita il flusso di K+ giù di gradiente elettrochimico. Inoltre descriviamo come calibrare gli elettrodi, come memorizzare e utilizzarli e, infine, come distribuirle per misurare K+ concentrazione dinamica in fettine di cervello hippocampal acuta da topi adulti. L’uso di tali elettrodi insieme ai topi geneticamente modificati che non dispongono di canali ionici specifico proposti per regolare extracellulare K+ dinamica dovrebbe rivelare i meccanismi cellulari utilizzati dal sistema nervoso per controllare la concentrazione ambientale di K + nell’ambiente extracellulare.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo che descriviamo qui ci ha permesso di valutare K+ dinamiche in risposta alla stimolazione elettrica dei collaterals Schaffer in fettine ippocampali acute da topi adulti. Il nostro metodo di preparazione K+ microelettrodi selettiva dello ione è simile a precedenti procedure descritte12,13,14,15. Tuttavia, questo metodo presenta vantaggi rispetto alle configurazio…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il laboratorio di Khakh è stato sostenuto da NIH MH104069. Il laboratorio Mody è stato sostenuto da NIH NS030549. J.C.O. grazie Grant(NS058280) formazione di NIH T32 neurale microcircuiti.
Materials
| Vibratome | DSK | Microslicer Zero 1 | |
| Mouse: C57BL/6NTac inbred mice | Taconic | Stock#B6 | |
| Microscope | Olympus | BX51 | |
| Electrode puller | Sutter | P-97 | |
| Ag/AgCl ground pellet | WPI | EP2 | |
| pCLAMP10.3 | Molecular Devices | n/a | |
| Custom microfil 28G tip | World precision instruments | CMF28G | |
| Tungsten Rod | A-M Systems | 716000 | |
| Bipolar stimulating electrodes | FHC | MX21XEW(T01) | |
| Stimulus isolator | World precision instruments | A365 | |
| Grass S88 Stimulator | Grass Instruments Company | S88 | |
| Borosilicate glass pipettes | World precision instruments | 1B150-4 | |
| A to D board | Digidata 1322A | Axon Instruments | |
| Signal Amplifier | Multiclamp 700A or 700B | Axon Instruments | |
| Headstage | CV-7B Cat 1 | Axon Instruments | |
| Patch computer | Dell | n/a | |
| Sodium Chloride | Sigma | S5886 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P3911 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S0751 | |
| D-glucose | Sigma | G7528 | |
| Calcium Chloride | Sigma | 21108 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | |
| valinomycin | Sigma | V0627-10mg | |
| 1,2-dimethyl-3-nitrobenzene | Sigma | 40870-25ml | |
| Potassium tetrakis (4-chlorophenyl)borate | Sigma | 60591-100mg | |
| 5% dimethyldichlorosilane in heptane | Sigma | 85126-5ml | |
| TTX | Cayman Chemical Company | 14964 | |
| Hydrochloric acid | Sigma | H1758-500mL | |
| Sucrose | Sigma | S9378-5kg | |
| Pipette Micromanipulator | Sutter | MP-285 / ROE-200 / MPC-200 | |
| Objective lens | Olympus | PlanAPO 10xW |
References
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