Fabrication, des essais et à l’aide de microélectrodes sensibles aux ions Potassium dans des tranches de tissu du cerveau adulte
Summary
Les ions potassium contribuent au potentiel de repos membranaire des cellules et la concentration extracellulaire de K+ est un régulateur crucial de l’excitabilité cellulaire. Nous décrivons comment faire, calibrer et utiliser monopolaire K+-microélectrodes. L’utilisation de telles électrodes permet la mesure de la dynamique de concentration K+ évoquée électriquement dans des tranches d’hippocampe adultes.
Abstract
Ions potassium considérablement contribuent au potentiel de repos membranaire des cellules et, par conséquent, la concentration extracellulaire de K+ est un régulateur crucial de l’excitabilité cellulaire. Modifié les concentrations extracellulaires K+ affect l’excitabilité de cellulaires et potentiels membranaires au repos en déplaçant les équilibres entre États fermés, ouverts et inactivés pour les canaux ioniques voltage-dépendants qui sous-tendent le potentiel d’action initiation et conduction. Par conséquent, il est utile de mesurer directement extracellulaires K+ dynamique en santé et malades États. Nous décrivons ici, comment faire, calibrer et utiliser monopolaire K+-microélectrodes. Nous avons eux déployé dans des tranches de cerveau hippocampe adulte mesure évoquée électriquement dynamique de concentration K+ . L’utilisation judicieuse de ces électrodes est une partie importante de la trousse d’outils nécessaire à l’évaluation des mécanismes cellulaires et biophysiques qui contrôlent les concentrations extracellulaires de K+ dans le système nerveux.
Introduction
Concentrations d’ions de potassium sont étroitement réglementées dans le cerveau, et leurs fluctuations exercent une influence puissante sur le potentiel membranaire de repos de toutes les cellules. À la lumière de ces contributions critiques, un objectif important de la biologie est de déterminer les mécanismes cellulaires et biophysiques qui servent à bien réguler la concentration de K+ dans l’espace extracellulaire dans les différents organes du corps1 , 2. une exigence importante dans ces études est la possibilité de mesurer avec précision les concentrations de K+ . Bien que de nombreux composants qui contribuent à l’homéostasie de potassium dans le cerveau dans les États sains et malades ont été identifiés3,4,5, encore des progrès a été ralentie en raison de la nature spécialisée du préparation de microélectrodes ion pour la mesure de potassium. Capteurs de la microélectrode représentent l’étalon-or pour la mesure K+ concentrations in vitro, en tranches de tissus et in vivo.
Nouvelles approches pour K+ de surveillance sont en cours d’élaboration à l’aide de capteurs optiques, cependant elles ne détectent pas une concentration de gamme biologiquement pertinente de K+ ou n’ont pas été pleinement vérifiées dans les systèmes biologiques, bien que les premiers résultats semble prometteuse6,7,8. Par rapport aux capteurs optiques, microélectrodes sont fondamentalement limitées à une mesure de source ponctuelle des ions, bien que les rangées d’électrodes susceptibles d’améliorer la résolution spatiale9. Cet article se concentre sur les capteurs de la microélectrode Canon unique pour le suivi dynamique de K+ .
Dans cet ouvrage, les auteurs rapportent des procédures détaillées pas à pas faire K+ microélectrodes, utilisant un ionophore valinomycine-basé de potassium qui permet très sélectif (104 fois K+ à sélectivité Na+ ) K+ mouvement sur membranes10. Un polypeptide d’origine naturelle, valinomycine agit comme un pore de perméabilité K+ et facilite l’écoulement de K+ vers le bas de son gradient électrochimique. On décrit aussi comment calibrer les électrodes, comment stocker et les utiliser et enfin comment déployer afin de mesurer la dynamique de concentration K+ en tranches aiguë hippocampe cerveau de souris adultes. L’utilisation de telles électrodes ainsi que des souris génétiquement modifiées qui n’ont pas les canaux ioniques spécifiques proposés de réglementer extracellulaires K+ dynamique devrait révéler les mécanismes cellulaires utilisés par le système nerveux pour contrôler la concentration ambiante de K + dans le milieu extracellulaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthode que nous décrivons ici nous a permis d’évaluer la dynamique K+ en réponse à une stimulation électrique des collatérales de Schaffer dans des tranches d’hippocampe aiguës de souris adultes. Notre méthode de préparation des microélectrodes ion K+ est semblable au plus tôt des procédures décrites12,13,14,15. Toutefois, cette méthode présente des…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le laboratoire Khakh était soutenu par le NIH MH104069. Le laboratoire Mody était soutenu par le NIH NS030549. J.C.O. Merci le NIH T32 Neural Microcircuits formation Grant(NS058280).
Materials
| Vibratome | DSK | Microslicer Zero 1 | |
| Mouse: C57BL/6NTac inbred mice | Taconic | Stock#B6 | |
| Microscope | Olympus | BX51 | |
| Electrode puller | Sutter | P-97 | |
| Ag/AgCl ground pellet | WPI | EP2 | |
| pCLAMP10.3 | Molecular Devices | n/a | |
| Custom microfil 28G tip | World precision instruments | CMF28G | |
| Tungsten Rod | A-M Systems | 716000 | |
| Bipolar stimulating electrodes | FHC | MX21XEW(T01) | |
| Stimulus isolator | World precision instruments | A365 | |
| Grass S88 Stimulator | Grass Instruments Company | S88 | |
| Borosilicate glass pipettes | World precision instruments | 1B150-4 | |
| A to D board | Digidata 1322A | Axon Instruments | |
| Signal Amplifier | Multiclamp 700A or 700B | Axon Instruments | |
| Headstage | CV-7B Cat 1 | Axon Instruments | |
| Patch computer | Dell | n/a | |
| Sodium Chloride | Sigma | S5886 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P3911 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S0751 | |
| D-glucose | Sigma | G7528 | |
| Calcium Chloride | Sigma | 21108 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | |
| valinomycin | Sigma | V0627-10mg | |
| 1,2-dimethyl-3-nitrobenzene | Sigma | 40870-25ml | |
| Potassium tetrakis (4-chlorophenyl)borate | Sigma | 60591-100mg | |
| 5% dimethyldichlorosilane in heptane | Sigma | 85126-5ml | |
| TTX | Cayman Chemical Company | 14964 | |
| Hydrochloric acid | Sigma | H1758-500mL | |
| Sucrose | Sigma | S9378-5kg | |
| Pipette Micromanipulator | Sutter | MP-285 / ROE-200 / MPC-200 | |
| Objective lens | Olympus | PlanAPO 10xW |
References
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