Machen, Prüfung und Verwendung von Kalium-Ionen selektive Mikroelektroden im erwachsenen Gehirn Gewebe Scheiben

Summary

Kalium-Ionen zur Membran-Ruhepotential der Zellen und extrazellulären K⁺ -Konzentration ist ein entscheidender Regulator der zellulären Erregbarkeit. Wir beschreiben, wie zu machen, zu kalibrieren und monopolare K⁺-selektive Mikroelektroden. Mit Hilfe dieser Elektroden ermöglicht die Messung von elektrisch evozierten K⁺ Konzentration Dynamik in Erwachsene hippocampal Scheiben.

Abstract

Kalium-Ionen wesentlich dazu beitragen, die Membran-Ruhepotential der Zellen und extrazellulären K⁺ Konzentration ist daher ein entscheidender Regulator der Erregbarkeit der Zelle. Konzentrationen von extrazellulären K⁺ beeinflussen die ruhenden Membran potenzielle und zellulären Erregbarkeit durch Verschiebung der Gleichgewichte zwischen geschlossenen, offenen und inaktivierten im Hinblick auf spannungsabhängige Ionenkanäle, die Aktionspotentials zugrunde liegen verändert Initiierung und Leitung. Daher ist es wertvoll, extrazelluläre K⁺ Dynamik im Gesundheits- und Kranken Staaten direkt zu messen. Hier beschreiben wir, wie zu machen, zu kalibrieren und monopolare K⁺-selektive Mikroelektroden. Wir ihnen in Erwachsene hippocampal Gehirnscheiben elektrisch evozierten K⁺ Konzentration Dynamik Messen eingesetzt. Die vernünftige Nutzung von solchen Elektroden ist ein wichtiger Bestandteil der zelluläre und biophysikalische Mechanismen zu bewerten, die extrazelluläre K⁺ -Konzentrationen im Nervensystem Steuern musste Toolkit.

Introduction

Kalium-Ionen-Konzentrationen sind fest im Gehirn geregelt, und deren Schwankungen üben einen starken Einfluss auf die Membran-Ruhepotential aller Zellen. Im Hinblick auf diese kritische Beiträge ist ein wichtiges Ziel der Biologie, die zellulären und biophysikalischen Mechanismen zu bestimmen, die verwendet werden, um die Konzentration von K⁺ fest zu regulieren in den extrazellulären Raum in verschiedenen Organen des Körpers^{1 , 2}. eine wichtige Voraussetzung in diesen Studien ist die Fähigkeit, K⁺ Konzentrationen genau zu messen. Obwohl viele Komponenten, die zur Kalium Homöostase im Gehirn in gesunden und Kranken Staaten beitragen identifizierten^3,4,5, wurden wurde weitere Fortschritte aufgrund der speziellen Art der verlangsamte Messung von Kalium vorbereiten Ionen selektive Mikroelektroden. Mikroelektrode Sensoren sind der Goldstandard für die Messung von K⁺ -Konzentrationen in Vitro, Gewebe und in Vivo.

Neuere Ansätze zur K⁺ Überwachung sind in der Entwicklung mit optischen Sensoren, aber diese eine biologisch relevante Bereich von K⁺ -Konzentrationen nicht erkennen oder nicht wurde komplett in biologischen Systemen, überprüft haben obwohl erste Ergebnisse erscheinen Sie vielversprechend^6,7,8. Im Vergleich zu optischen Sensoren, sind Mikroelektroden grundsätzlich beschränkt sich auf eine Punktquelle Messung von Ionen, obwohl Elektroden die räumliche Auflösung⁹verbessert werden könnte. Dieser Artikel konzentriert sich auf die Einzel-barreled Mikroelektrode Sensoren zur Überwachung der K⁺ Dynamik.

In dieser Arbeit berichten wir detaillierte schrittweise Verfahren zu K⁺ selektive Mikroelektroden, mit einer Streptomyceten-basierte Kalium Ionophore, die hochselektiven erlaubt (10⁴ Fach K^{+ +} Na Selektivität) K⁺ Bewegung über Membranen¹⁰. Eine natürlich vorkommende Polypeptid, Streptomyceten fungiert als eine K⁺ durchlässige Pore und erleichtert den Fluss von K⁺ hinunter die elektrochemischen Gradienten. Wir beschreiben auch, wie die Elektroden zu kalibrieren wie zu speichern und sie verwenden und schließlich zur Messung der K⁺ Konzentration Dynamik in akuten hippocampal Hirnschnitten von Erwachsenen Mäusen bereitgestellt. Die Verwendung von solchen Elektroden zusammen mit genetisch veränderten Mäusen, die spezifische Ionenkanäle vorgeschlagen, extrazelluläre K⁺ Dynamik regulieren fehlt zeigen sollte, die zellulären Mechanismen verwendet durch das Nervensystem, die ambient Konzentration von K zu kontrollieren ⁺ in das extrazelluläre Milieu.

Protocol

Alle Tierversuche wurden durchgeführt in Übereinstimmung mit den nationalen Institut Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren und wurden von der Kanzlers Animal Research Committee an der University of California, Los Angeles genehmigt. Alle Mäuse waren mit Futter und Wasser zur Verfügung Ad Libitum in einer 12 h hell-dunkel-Umgebung untergebracht. Alle Tiere waren gesund mit keine offensichtlichen Verhaltensänderungen, nicht in früheren Studien einbezogen wurden und während der lichtzyk…

Representative Results

Für selektive Messung der extrazellulären K+bereiteten wir IONENSELEKTIVE Mikroelektroden beschichtet mit einer hydrophoben Schicht durch Silanisierung sauber Borosilikatglas Pipetten (Abbildung 1A). Diese Beschichtung ermöglicht die K+ -Ionophore mit Streptomyceten zum Ausruhen an der Spitze der Elektrode und erlauben nur K+ Fluss durch eine schmale Öffnung an der Elektrodenspitze (Abbildung 1 b</stro…

Discussion

Die Methode, die wir hier beschreiben konnten wir K⁺ Dynamik als Reaktion auf die elektrische Stimulation von Schaffer Sicherheiten in akuten hippocampal Scheiben von Erwachsenen Mäusen zu beurteilen. Unsere Methode der Vorbereitung K⁺ Ion selektiv Mikroelektroden ist ähnlich wie bei den zuvor beschriebenen Verfahren^12,13,14,15. Diese Methode hat jedoch Vorteile gegenüb…

Materials

Vibratome	DSK	Microslicer Zero 1
Mouse: C57BL/6NTac inbred mice	Taconic	Stock#B6
Microscope	Olympus	BX51
Electrode puller	Sutter	P-97
Ag/AgCl ground pellet	WPI	EP2
pCLAMP10.3	Molecular Devices	n/a
Custom microfil 28G tip	World precision instruments	CMF28G
Tungsten Rod	A-M Systems	716000
Bipolar stimulating electrodes	FHC	MX21XEW(T01)
Stimulus isolator	World precision instruments	A365
Grass S88 Stimulator	Grass Instruments Company	S88
Borosilicate glass pipettes	World precision instruments	1B150-4
A to D board	Digidata 1322A	Axon Instruments
Signal Amplifier	Multiclamp 700A or 700B	Axon Instruments
Headstage	CV-7B Cat 1	Axon Instruments
Patch computer	Dell	n/a
Sodium Chloride	Sigma	S5886
Potassium Chloride	Sigma	P3911
HEPES	Sigma	H3375
Sodium Bicarbonate	Sigma	S5761
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma	S0751
D-glucose	Sigma	G7528
Calcium Chloride	Sigma	21108
Magnesium Chloride	Sigma	M8266
valinomycin	Sigma	V0627-10mg
1,2-dimethyl-3-nitrobenzene	Sigma	40870-25ml
Potassium tetrakis (4-chlorophenyl)borate	Sigma	60591-100mg
5% dimethyldichlorosilane in heptane	Sigma	85126-5ml
TTX	Cayman Chemical Company	14964
Hydrochloric acid	Sigma	H1758-500mL
Sucrose	Sigma	S9378-5kg
Pipette Micromanipulator	Sutter	MP-285 / ROE-200 / MPC-200
Objective lens	Olympus	PlanAPO 10xW