作成、テスト、および成人の脳の切片でカリウム イオン選択的な電極を使用して
Summary
カリウム イオンは細胞の静止膜電位に貢献し、細胞外の K+濃度細胞興奮性の重要な調節因子であります。確認、調整、モノポーラ K+を使用する方法について説明-選択的な電極。そのような電極を使用すると、大人の海馬スライスにおける電気的誘発 K+濃度動態の測定ができます。
Abstract
カリウム イオンは細胞の静止膜電位に貢献し、そのため、細胞外の K+濃度は細胞興奮性の重要な調節因子。活動電位の根底にある電位依存性イオン チャネルのクローズ、オープン、不活化状態間の平衡をシフトすることによって静止膜電位および細胞内興奮性細胞外の K+影響の濃度を変更発生と伝導。したがって、健康と病気にかかった状態で細胞外の K+のダイナミクスを直接測定する貴重なです。ここでは、確認、調整および単極 K+を使用する方法について述べる-選択的な電極。我々 は電気的誘発 K+濃度動態を測定する成体海馬スライスで展開します。そのような電極の賢い使用は神経系における細胞外の K+の濃度を制御する細胞および生物物理学的メカニズムを評価するために必要なツール キットの重要な部分です。
Introduction
カリウム イオンの濃度が脳内で堅く調整され、それらの変動はすべての細胞の静止膜電位に強力な影響を及ぼします。これらの重要な貢献の観点から、生物学の重要な目標は、1体のさまざまな器官の細胞外スペースでしっかりと K+の濃度を調節するために使用する細胞および生物物理学的メカニズムを決定することです。,2。 これらの研究で重要な要件は、K+濃度を正確に測定する能力。健康と病気の状態では、脳でカリウムの恒常性に貢献する多くのコンポーネントされているが、識別された3,4、5、さらに進行中の専門にされた性質のため抑制されていますカリウム測定用イオン選択性電極の準備。電極センサーを表す K+濃度の in vitro組織スライスのin vivo測定のゴールド スタンダード。
監視 K+のための新しいアプローチがしかし、これらは生物学的関連性の高い範囲の K+濃度を検出しないまたはない吟味されている完全に生体が光センサーを使用して開発中の最初の結果有望な6,7,8が表示されます。光センサーと比較して、電極、電極アレイ9空間分解能を向上させることが根本的にイオンの点光源測定に限定。K+の動態を監視するため銃身の単一電極センサーについて説明します。
この仕事で K+の選択的な電極、高選択的許可バリノマイシン ベース カリウム イオノフォアを使用して (104倍 K+ Na+選択性) をする段階的な手順の詳細は報告する K+膜10を移動します。自然に発生するポリペプチド、バリノマイシンは K+透水性孔として機能し、それの電気化学的勾配を K+の流れが容易になります。電極を調整する方法についても述べる保存し、それらを使用する方法、最後に大人のマウスから急性海馬脳スライスの K+濃度動態を測定するための展開方法について。特定のイオン チャネル細胞外 K+のダイナミクスを規制する提案を持たない遺伝子改変マウスと共にそのような電極を使用する必要があります K の大気中濃度を制御する神経系によって使用される細胞メカニズムを明らかにします。+細胞外の環境の中で。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明するメソッドを使用して、K+大人のマウスから急性海馬スライスでシャファー側枝の電気刺激に対する応答のダイナミクスを評価するためができました。K+イオン選択的な電極を準備するための手法は、以前記載されている手順12,13,14,15に似ています。ただし、このメソ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Khakh ラボは、NIH の MH104069 によって支えられました。モディのラボは、NIH の NS030549 によって支えられました。J.C.O. は、NIH T32 神経回路トレーニング Grant(NS058280) のおかげでください。
Materials
| Vibratome | DSK | Microslicer Zero 1 | |
| Mouse: C57BL/6NTac inbred mice | Taconic | Stock#B6 | |
| Microscope | Olympus | BX51 | |
| Electrode puller | Sutter | P-97 | |
| Ag/AgCl ground pellet | WPI | EP2 | |
| pCLAMP10.3 | Molecular Devices | n/a | |
| Custom microfil 28G tip | World precision instruments | CMF28G | |
| Tungsten Rod | A-M Systems | 716000 | |
| Bipolar stimulating electrodes | FHC | MX21XEW(T01) | |
| Stimulus isolator | World precision instruments | A365 | |
| Grass S88 Stimulator | Grass Instruments Company | S88 | |
| Borosilicate glass pipettes | World precision instruments | 1B150-4 | |
| A to D board | Digidata 1322A | Axon Instruments | |
| Signal Amplifier | Multiclamp 700A or 700B | Axon Instruments | |
| Headstage | CV-7B Cat 1 | Axon Instruments | |
| Patch computer | Dell | n/a | |
| Sodium Chloride | Sigma | S5886 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P3911 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S0751 | |
| D-glucose | Sigma | G7528 | |
| Calcium Chloride | Sigma | 21108 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | |
| valinomycin | Sigma | V0627-10mg | |
| 1,2-dimethyl-3-nitrobenzene | Sigma | 40870-25ml | |
| Potassium tetrakis (4-chlorophenyl)borate | Sigma | 60591-100mg | |
| 5% dimethyldichlorosilane in heptane | Sigma | 85126-5ml | |
| TTX | Cayman Chemical Company | 14964 | |
| Hydrochloric acid | Sigma | H1758-500mL | |
| Sucrose | Sigma | S9378-5kg | |
| Pipette Micromanipulator | Sutter | MP-285 / ROE-200 / MPC-200 | |
| Objective lens | Olympus | PlanAPO 10xW |
References
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