Создание, тестирование и использование селективного микроэлектродов ионов калия в срезах тканей взрослого мозга
Summary
Ионы калия способствует покоя мембранного потенциала клеток и внеклеточной концентрации K+ является регулятором важнейших клеточных возбудимости. Мы опишем, как сделать, калибровки и использовать монополярной K+-селективный микроэлектродов. Использование таких электродов позволяет измерение электрически вызвала динамика концентрации K+ в взрослых срезах гиппокампа.
Abstract
Ионы калия значительный вклад покоя мембранного потенциала клеток и, таким образом, внеклеточной концентрации K+ является важным регулятором возбудимость клеток. Изменены концентрации внеклеточного K+ влияют покоя возбудимости потенциал и клеточные мембраны, сдвигая равновесие между закрытые, открытые и инактивированных государствами для напряжени тока зависимых ионных каналов, которые лежат в основе потенциал действия инициирование и проведение. Следовательно это ценный непосредственно измерить внеклеточного K+ динамика в области здравоохранения и государства в больными. Здесь мы опишем, как сделать, калибровки и использовать монополярной K+-селективный микроэлектродов. Мы развернули их ломтиками взрослого мозга гиппокампа для измерения электрически вызвала динамика концентрации K+ . Разумное использование таких электродов является важной частью инструментария, необходимых для оценки сотовой и биофизические механизмы, которые управляют внеклеточной концентрации K+ в нервной системе.
Introduction
Концентрации ионов калия жестко регулируется в головном мозге, и их колебания оказывают мощное влияние на мембранного потенциала покоя всех клеток. С учетом этих критических взносов важная цель биологии является определить сотовой и биофизические механизмы, которые используются жестко регулировать концентрацию K+ в внеклеточного пространства в различных органах тела1 , 2. важным требованием в этих исследованиях является способность точно измерить концентрации K+ . Хотя многие компоненты, которые способствуют калия гомеостаза в мозге в здоровых и больных государства были определены3,4,5, далее прогресс замедлился ввиду специализированного характера подготовка выборочной микроэлектродов иона калия измерения. Микроэлектродные датчики представляют собой золотой стандарт для измерения K+ концентрации в пробирке, фрагменты тканей и в естественных условиях.
Новые подходы для K+ мониторинга находятся в стадии разработки, с помощью оптических датчиков, однако они не обнаружить концентрации биологически соответствующий диапазон K+ или у не были проверены полностью в биологических системах, хотя первоначальные результаты появляются многообещающие6,,78. По сравнению с оптическими датчиками, микроэлектродов принципиально ограничены для измерения точки источника ионов, хотя массивы электродов может улучшить пространственное разрешение9. Эта статья сфокусирована на сингл бочковая микроэлектродные датчики для мониторинга динамики K+ .
В этой работе, мы докладе подробные ступенчатой процедуры сделать K+ селективный микроэлектродов, используя ionophore на основе valinomycin калия, который позволяет весьма избирательно (104 раза K+ к избирательности Na+ ) K+ движение через мембраны10. Естественно-происходя полипептид, valinomycin действует как K+ проницаемых поры и облегчает стекают K+ электрохимических градиента. Мы также описывают, как для калибровки электродов, как хранить и использовать их и, наконец, как развернуть их для измерения K+ динамика концентрации в кусочки острый гиппокампа мозга от взрослых мышей. Использование таких электродов вместе с генетически измененных мышей, которые не имеют конкретных ионных каналов, предлагается регулировать внеклеточного K+ динамика должна выявить клеточных механизмов, используемых нервной системой для управления окружающего концентрация K + в внеклеточной окружение.
Protocol
Representative Results
Discussion
Метод, который мы здесь описывать позволила нам оценить динамику K+ в ответ на электрической стимуляции Шаффер залогов в острой срезах гиппокампа от взрослых мышей. Наш метод подготовки K+ Ион селективного микроэлектродов похож на ранее описанные процедуры12,<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Khakh лаборатории было поддержано MH104069 низ. Mody лаборатории было поддержано NS030549 низ. J.C.O. Спасибо Grant(NS058280) обучения NIH T32 нейронных микросхемы.
Materials
| Vibratome | DSK | Microslicer Zero 1 | |
| Mouse: C57BL/6NTac inbred mice | Taconic | Stock#B6 | |
| Microscope | Olympus | BX51 | |
| Electrode puller | Sutter | P-97 | |
| Ag/AgCl ground pellet | WPI | EP2 | |
| pCLAMP10.3 | Molecular Devices | n/a | |
| Custom microfil 28G tip | World precision instruments | CMF28G | |
| Tungsten Rod | A-M Systems | 716000 | |
| Bipolar stimulating electrodes | FHC | MX21XEW(T01) | |
| Stimulus isolator | World precision instruments | A365 | |
| Grass S88 Stimulator | Grass Instruments Company | S88 | |
| Borosilicate glass pipettes | World precision instruments | 1B150-4 | |
| A to D board | Digidata 1322A | Axon Instruments | |
| Signal Amplifier | Multiclamp 700A or 700B | Axon Instruments | |
| Headstage | CV-7B Cat 1 | Axon Instruments | |
| Patch computer | Dell | n/a | |
| Sodium Chloride | Sigma | S5886 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P3911 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S0751 | |
| D-glucose | Sigma | G7528 | |
| Calcium Chloride | Sigma | 21108 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | |
| valinomycin | Sigma | V0627-10mg | |
| 1,2-dimethyl-3-nitrobenzene | Sigma | 40870-25ml | |
| Potassium tetrakis (4-chlorophenyl)borate | Sigma | 60591-100mg | |
| 5% dimethyldichlorosilane in heptane | Sigma | 85126-5ml | |
| TTX | Cayman Chemical Company | 14964 | |
| Hydrochloric acid | Sigma | H1758-500mL | |
| Sucrose | Sigma | S9378-5kg | |
| Pipette Micromanipulator | Sutter | MP-285 / ROE-200 / MPC-200 | |
| Objective lens | Olympus | PlanAPO 10xW |
References
- McDonough, A. A., Youn, J. H. Potassium homeostasis: The knowns, the unknowns, and the health benefits. Physiol Bethesda Md. 32 (2), 100-111 (2017).
- Hille, B. . Ion channels of excitable membranes. , 507 (2001).
- Kofuji, P., Ceelen, P., Zahs, K. R., Surbeck, L. W., Lester, H. A., Newman, E. A. Genetic inactivation of an inwardly rectifying potassium channel (Kir4.1 subunit) in mice: Phenotypic impact in retina. J Neurosci. 20 (15), 5733-5740 (2000).
- Sibille, J., Dao Duc, K., Holcman, D., Rouach, N. The neuroglial potassium cycle during neurotransmission: role of Kir4.1 channels. PLoS Comput Biol. 11 (3), e1004137 (2015).
- Tong, X., et al. Astrocyte Kir4.1 ion channel deficits contribute to neuronal dysfunction in Huntington’s disease model mice. Nat Neurosci. 17 (5), 694-703 (2014).
- Datta, D., Sarkar, K., Mukherjee, S., Meshik, X., Stroscio, M. A., Dutta, M. Graphene oxide and DNA aptamer based sub-nanomolar potassium detecting optical nanosensor. Nanotechnology. 28 (32), 325502 (2017).
- Bandara, H. M. D., et al. Palladium-Mediated Synthesis of a Near-Infrared Fluorescent K+ Sensor. J Org Chem. 82 (15), 8199-8205 (2017).
- Depauw, A., et al. A highly selective potassium sensor for the detection of potassium in living tissues. Chem Weinh Bergstr Ger. 22 (42), 14902-14911 (2016).
- Machado, R., et al. Biofouling-Resistant Impedimetric Sensor for Array High-Resolution Extracellular Potassium Monitoring in the Brain. Biosensors. 6 (4), (2016).
- Rose, M. C., Henkens, R. W. Stability of sodium and potassium complexes of valinomycin. Biochim Biophys Acta BBA – Gen Subj. 372 (2), 426-435 (1974).
- Ammann, D., Chao, P., Simon, W. Valinomycin-based K+ selective microelectrodes with low electrical membrane resistance. Neurosci Lett. 74 (2), 221-226 (1987).
- Amzica, F., Steriade, M. Neuronal and glial membrane potentials during sleep and paroxysmal oscillations in the neocortex. J Neurosci. 20 (17), 6648-6665 (2000).
- Amzica, F., Steriade, M. The functional significance of K-complexes. Sleep Med Rev. 6 (2), 139-149 (2002).
- MacVicar, B. A., Feighan, D., Brown, A., Ransom, B. Intrinsic optical signals in the rat optic nerve: role for K(+) uptake via NKCC1 and swelling of astrocytes. Glia. 37 (2), 114-123 (2002).
- Chever, O., Djukic, B., McCarthy, K. D., Amzica, F. Implication of Kir4.1 channel in excess potassium clearance: an in vivo study on anesthetized glial-conditional Kir4.1 knock-out mice. J Neurosci. 30 (47), 15769-15777 (2010).
- Hall, D. G. Ion-selective membrane electrodes: A general limiting treatment of interference effects. J Phys Chem. 100 (17), 7230-7236 (1996).
- Haack, N., Durry, S., Kafitz, K. W., Chesler, M., Rose, C. R. Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue. J Vis Exp. (103), e53058 (2015).
- Larsen, B. R., MacAulay, N. Kir4.1-mediated spatial buffering of K(+): Experimental challenges in determination of its temporal and quantitative contribution to K(+) clearance in the brain. Channels Austin Tex. 8 (6), 544-550 (2014).
- Mei, L., et al. Long-term in vivo recording of circadian rhythms in brains of freely moving mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, 4276-4281 (2018).
