Fabricación, pruebas y uso de microelectrodos selectivos de Ion potasio en rebanadas del tejido del cerebro adulto
Summary
Iones del potasio contribuyen al reclinación potencial de la membrana de las células y la concentración extracelular de K+ es un regulador crucial de excitabilidad celular. Describimos cómo realizar, calibrar y utilizar monopolar K+-microelectrodos selectivos. Uso de tales electrodos permite la medición de la dinámica de concentración de K+ eléctricamente evocado en rebanadas de hipocampales adulto.
Abstract
Los iones de potasio contribuyen significativamente al reclinación potencial de la membrana de las células y, por tanto, la concentración extracelular de K+ es un regulador crucial de la excitabilidad de la célula. Altera las concentraciones de efecto extracelular de K+ la excitabilidad celular y potencial de membrana reposo cambiando los equilibrios entre los Estados cerrados y abiertos inactivados para canales voltaje-dependientes del ion que subyacen a potencial de acción iniciación y conducción. Por lo tanto, es valiosa para medir directamente la dinámica extracelular de K+ en salud y los Estados enfermos. Aquí, describimos cómo realizar, calibrar y utilizar monopolar K+-microelectrodos selectivos. Les implantamos en rebanadas de cerebro hipocampo adulto para medir eléctricamente evocado dinámica de concentración de K+ . El uso juicioso de estos electrodos es una parte importante de las herramientas necesarias para evaluar los mecanismos celulares y biofísicos que controlan las concentraciones extracelulares de K+ en el sistema nervioso.
Introduction
Las concentraciones de iones de potasio están estrictamente reguladas en el cerebro, y sus fluctuaciones ejercen una poderosa influencia sobre el potencial de membrana en reposo de todas las células. A la luz de estos aportes críticos, un objetivo importante de la biología es determinar los mecanismos celulares y biofísicos que se utilizan para regular estrechamente la concentración de K+ en el espacio extracelular en diferentes órganos del cuerpo1 , 2. un requisito importante en estos estudios es la capacidad de medir con precisión las concentraciones de K+ . Aunque muchos componentes que contribuyen a la homeostasis del potasio en el cerebro en Estados sanos y enfermos se han identificado3,4,5, más progreso ha sido más lento debido a la naturaleza especializada de preparación de microelectrodos selectivos de iones para la medición de potasio. Sensores de microelectrodo representan el estándar de oro para la medición de K+ concentraciones en vitro, en rebanadas de tejido y en vivo.
Nuevos enfoques para K+ control están bajo desarrollo de sensores ópticos, sin embargo estos no detectan una concentraciones biológicamente relevante rango de K+ o han no sido completamente validados en los sistemas biológicos, aunque los resultados iniciales parece prometedor6,7,8. En comparación con sensores ópticos, microelectrodos son fundamentalmente limitadas a una medición puntual de iones, aunque arreglos de electrodos podrían mejorar la resolución espacial9. Este artículo se centra en los sensores de microelectrodo sola-barreled para el monitoreo de la dinámica de K+ .
En este trabajo, nos informe los procedimientos detallados paso a paso para hacer K+ microelectrodos selectivos, usar un ionóforo valinomycin basado en potasio que permite altamente selectiva (104 veces K+ a selectividad Na+ ) K+ movimiento sobre membranas10. Un polipéptido natural, valinomycin actúa como un poro permeable de K+ y facilita el flujo de K+ hacia abajo de su gradiente electroquímico. También describimos cómo calibrar los electrodos, cómo almacenar y utilizarlos y, finalmente, cómo implementar para medir la dinámica de concentración de K+ en rebanadas agudo cerebro hipocampo de ratones adultos. El uso de tales electrodos junto con ratones modificados genéticamente que carecen de canales iónicos específicos de propuestas para regular la dinámica de K+ extracelular debe revelar los mecanismos celulares utilizados por el sistema nervioso para el control de la concentración ambiental de K + en el medio extracelular.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método que Describimos aquí nos ha permitido evaluar la dinámica de K+ en respuesta a la estimulación eléctrica de collaterals de Schaffer en rebanadas hippocampal agudas de ratones adultos. Nuestro método de preparación K+ de microelectrodos selectivos de ion es similar al anteriormente descrito procedimientos12,13,14,15. Sin embargo, este método tiene ventajas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El laboratorio de Khakh fue apoyado por los NIH MH104069. El laboratorio de Mody fue apoyado por NIH NS030549. J.C.O. gracias la Grant(NS058280) de formación Microcircuitos neuronales NIH T32.
Materials
| Vibratome | DSK | Microslicer Zero 1 | |
| Mouse: C57BL/6NTac inbred mice | Taconic | Stock#B6 | |
| Microscope | Olympus | BX51 | |
| Electrode puller | Sutter | P-97 | |
| Ag/AgCl ground pellet | WPI | EP2 | |
| pCLAMP10.3 | Molecular Devices | n/a | |
| Custom microfil 28G tip | World precision instruments | CMF28G | |
| Tungsten Rod | A-M Systems | 716000 | |
| Bipolar stimulating electrodes | FHC | MX21XEW(T01) | |
| Stimulus isolator | World precision instruments | A365 | |
| Grass S88 Stimulator | Grass Instruments Company | S88 | |
| Borosilicate glass pipettes | World precision instruments | 1B150-4 | |
| A to D board | Digidata 1322A | Axon Instruments | |
| Signal Amplifier | Multiclamp 700A or 700B | Axon Instruments | |
| Headstage | CV-7B Cat 1 | Axon Instruments | |
| Patch computer | Dell | n/a | |
| Sodium Chloride | Sigma | S5886 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P3911 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S0751 | |
| D-glucose | Sigma | G7528 | |
| Calcium Chloride | Sigma | 21108 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | |
| valinomycin | Sigma | V0627-10mg | |
| 1,2-dimethyl-3-nitrobenzene | Sigma | 40870-25ml | |
| Potassium tetrakis (4-chlorophenyl)borate | Sigma | 60591-100mg | |
| 5% dimethyldichlorosilane in heptane | Sigma | 85126-5ml | |
| TTX | Cayman Chemical Company | 14964 | |
| Hydrochloric acid | Sigma | H1758-500mL | |
| Sucrose | Sigma | S9378-5kg | |
| Pipette Micromanipulator | Sutter | MP-285 / ROE-200 / MPC-200 | |
| Objective lens | Olympus | PlanAPO 10xW |
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