Yapma, test etme ve yetişkin beyin doku dilimler halinde potasyum iyon seçici Microelectrodes kullanma
Summary
Potasyum iyonları hücre istirahat membran potansiyelini katkıda bulunmak ve ekstraselüler K+ konsantrasyon hücresel uyarılabilirlik çok önemli bir düzenleyicisidir. Biz nasıl yapmak, kalibre ve monopolar K+tarif-seçici microelectrodes. Böyle elektrotları kullanarak elektriksel olarak uyarılmış K+ konsantrasyon dynamics yetişkin Hipokampal dilimleri içinde ölçüm sağlar.
Abstract
Potasyum iyonları hücre istirahat membran potansiyelini önemli ölçüde katkıda bulunmak, bu nedenle, ve ekstraselüler K+ konsantrasyonu hücre uyarılabilirlik çok önemli bir regülatör. Aksiyon potansiyeli altında yatan voltaj bağımlı iyon kanalları için kapalı, açık ve Inaktif devletler arasında denge ilerletmeniz istirahat membran potansiyeli ve hücresel uyarılabilirlik ekstraselüler K+ etkiler konsantrasyonları değişmiş başlatma ve iletken. Bu nedenle, doğrudan hücre dışı K+ dynamics sağlık ve hastalıklı Birleşik ölçmek için değerlidir. Burada, nasıl yapmak, kalibre ve monopolar K+tarif-seçici microelectrodes. Biz onları elektriksel olarak uyarılmış K+ konsantrasyon dynamics ölçmek için yetişkin Hipokampal beyin dilimler halinde dağıtılabilir. Böyle elektrotlar akılcı kullanımı ekstraselüler K+ konsantrasyonları sinir sisteminde kontrol hücresel ve biyofizik mekanizmalar değerlendirmek için gerekli araç kitinin önemli bir parçasıdır.
Introduction
Potasyum iyon konsantrasyonlarının sıkıca beyinde düzenlenir ve onların dalgalanmaları istirahat membran potansiyeli tüm hücrelerin üzerinde güçlü bir etkisi uygulamak. Bu kritik katkıları ışığında Biyoloji önemli bir amacı sıkı K+ konsantrasyonu düzenlemek için kullanılan hücresel ve biyofiziksel mekanizmaları hücre dışı alan vücut1 farklı organlarda belirlemektir , 2. bu çalışmalarda önemli bir gereksinimi K+ konsantrasyonları doğru ölçmek için yeteneğidir. Sağlıklı ve hastalıklı Birleşik beyinde homeostazı potasyum katkıda birçok bileşeni tanımlanan3,4,5, olmasına rağmen daha fazla ilerleme özel yapısı nedeniyle yavaşladı İyon seçici microelectrodes potasyum ölçüm için hazırlanıyor. Elektrot sensörler K+ konsantrasyonları vitro, dokusu dilimlerin ve içinde vivoölçmek için altın standart temsil eder.
K+ için yeni yaklaşımlar izleme bunlar biyolojik ilgili aralığı K+ konsantrasyonları algılamaz veya tamamen biyolojik sistemlerde, her ne kadar incelenmesi değil ancak optik sensörler, kullanarak ilk sonuçları geliştiriliyor gelecek vaat eden6,7,8görünür. Elektrot dizilerin Uzaysal çözünürlük9artırabilirsiniz optik sensörler için karşılaştırıldığında, microelectrodes temelde bir nokta kaynak ölçüyle iyonlar, sınırlı olmakla birlikte. Bu makale K+ dynamics izlemek için tek namlulu elektrot sensörler üzerinde duruluyor.
Bu çalışmada, biz K+ selektif microelectrodes, (104 kat K+ Na+ seçicilik) çok seçici izin veren bir valinomycin tabanlı potasyum ionophore kullanarak yapmak için detaylı kademeli işlemler raporu K+ membranlar10üzerinden hareket. Doğal olarak meydana gelen bir polipeptit valinomycin K+ geçirgen gözenek davranır ve K+ akış aşağı ‘s elektrokimyasal gradyan kolaylaştırır. Biz de elektrotlar, kalibre açıklar nasıl depolamak ve bunları kullanmak ve nihayet onları K+ konsantrasyon dinamiklerini akut Hipokampal beyin dilimleri yetişkin fareler üzerinden ölçmek için daà ° ã½tma. Böyle elektrotlar ile birlikte hücre dışı K+ dynamics düzenleyen için önerilen belirli iyon kanalları eksikliği genetiği değiştirilmiş fare kullanımı K ortam konsantrasyonu kontrol etmek için sinir sistemi tarafından kullanılan hücresel mekanizmaları ortaya çıkarmak + ekstrasellüler ortamında.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biz burada tarif yöntemi bize K+ dynamics yetişkin fareler tarafından yapılan yanıt Schaffer de¤erler akut Hipokampal dilimleri içinde elektrik stimülasyon olarak değerlendirmek izin verdi. K+ iyon seçici microelectrodes hazırlama bizim daha önce açıklanan yordamları12,13,14,15‘ e benzer bir yöntemdir. Ancak, hızlı ve basit K+ selektif microele…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Khakh laboratuvar NIH MH104069 tarafından desteklenmiştir. Mody laboratuvar NIH NS030549 tarafından desteklenmiştir. J.C.O. NIH T32 sinirsel Mikri şemalar eğitim Grant(NS058280) teşekkürler.
Materials
| Vibratome | DSK | Microslicer Zero 1 | |
| Mouse: C57BL/6NTac inbred mice | Taconic | Stock#B6 | |
| Microscope | Olympus | BX51 | |
| Electrode puller | Sutter | P-97 | |
| Ag/AgCl ground pellet | WPI | EP2 | |
| pCLAMP10.3 | Molecular Devices | n/a | |
| Custom microfil 28G tip | World precision instruments | CMF28G | |
| Tungsten Rod | A-M Systems | 716000 | |
| Bipolar stimulating electrodes | FHC | MX21XEW(T01) | |
| Stimulus isolator | World precision instruments | A365 | |
| Grass S88 Stimulator | Grass Instruments Company | S88 | |
| Borosilicate glass pipettes | World precision instruments | 1B150-4 | |
| A to D board | Digidata 1322A | Axon Instruments | |
| Signal Amplifier | Multiclamp 700A or 700B | Axon Instruments | |
| Headstage | CV-7B Cat 1 | Axon Instruments | |
| Patch computer | Dell | n/a | |
| Sodium Chloride | Sigma | S5886 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P3911 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S0751 | |
| D-glucose | Sigma | G7528 | |
| Calcium Chloride | Sigma | 21108 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | |
| valinomycin | Sigma | V0627-10mg | |
| 1,2-dimethyl-3-nitrobenzene | Sigma | 40870-25ml | |
| Potassium tetrakis (4-chlorophenyl)borate | Sigma | 60591-100mg | |
| 5% dimethyldichlorosilane in heptane | Sigma | 85126-5ml | |
| TTX | Cayman Chemical Company | 14964 | |
| Hydrochloric acid | Sigma | H1758-500mL | |
| Sucrose | Sigma | S9378-5kg | |
| Pipette Micromanipulator | Sutter | MP-285 / ROE-200 / MPC-200 | |
| Objective lens | Olympus | PlanAPO 10xW |
References
- McDonough, A. A., Youn, J. H. Potassium homeostasis: The knowns, the unknowns, and the health benefits. Physiol Bethesda Md. 32 (2), 100-111 (2017).
- Hille, B. . Ion channels of excitable membranes. , 507 (2001).
- Kofuji, P., Ceelen, P., Zahs, K. R., Surbeck, L. W., Lester, H. A., Newman, E. A. Genetic inactivation of an inwardly rectifying potassium channel (Kir4.1 subunit) in mice: Phenotypic impact in retina. J Neurosci. 20 (15), 5733-5740 (2000).
- Sibille, J., Dao Duc, K., Holcman, D., Rouach, N. The neuroglial potassium cycle during neurotransmission: role of Kir4.1 channels. PLoS Comput Biol. 11 (3), e1004137 (2015).
- Tong, X., et al. Astrocyte Kir4.1 ion channel deficits contribute to neuronal dysfunction in Huntington’s disease model mice. Nat Neurosci. 17 (5), 694-703 (2014).
- Datta, D., Sarkar, K., Mukherjee, S., Meshik, X., Stroscio, M. A., Dutta, M. Graphene oxide and DNA aptamer based sub-nanomolar potassium detecting optical nanosensor. Nanotechnology. 28 (32), 325502 (2017).
- Bandara, H. M. D., et al. Palladium-Mediated Synthesis of a Near-Infrared Fluorescent K+ Sensor. J Org Chem. 82 (15), 8199-8205 (2017).
- Depauw, A., et al. A highly selective potassium sensor for the detection of potassium in living tissues. Chem Weinh Bergstr Ger. 22 (42), 14902-14911 (2016).
- Machado, R., et al. Biofouling-Resistant Impedimetric Sensor for Array High-Resolution Extracellular Potassium Monitoring in the Brain. Biosensors. 6 (4), (2016).
- Rose, M. C., Henkens, R. W. Stability of sodium and potassium complexes of valinomycin. Biochim Biophys Acta BBA – Gen Subj. 372 (2), 426-435 (1974).
- Ammann, D., Chao, P., Simon, W. Valinomycin-based K+ selective microelectrodes with low electrical membrane resistance. Neurosci Lett. 74 (2), 221-226 (1987).
- Amzica, F., Steriade, M. Neuronal and glial membrane potentials during sleep and paroxysmal oscillations in the neocortex. J Neurosci. 20 (17), 6648-6665 (2000).
- Amzica, F., Steriade, M. The functional significance of K-complexes. Sleep Med Rev. 6 (2), 139-149 (2002).
- MacVicar, B. A., Feighan, D., Brown, A., Ransom, B. Intrinsic optical signals in the rat optic nerve: role for K(+) uptake via NKCC1 and swelling of astrocytes. Glia. 37 (2), 114-123 (2002).
- Chever, O., Djukic, B., McCarthy, K. D., Amzica, F. Implication of Kir4.1 channel in excess potassium clearance: an in vivo study on anesthetized glial-conditional Kir4.1 knock-out mice. J Neurosci. 30 (47), 15769-15777 (2010).
- Hall, D. G. Ion-selective membrane electrodes: A general limiting treatment of interference effects. J Phys Chem. 100 (17), 7230-7236 (1996).
- Haack, N., Durry, S., Kafitz, K. W., Chesler, M., Rose, C. R. Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue. J Vis Exp. (103), e53058 (2015).
- Larsen, B. R., MacAulay, N. Kir4.1-mediated spatial buffering of K(+): Experimental challenges in determination of its temporal and quantitative contribution to K(+) clearance in the brain. Channels Austin Tex. 8 (6), 544-550 (2014).
- Mei, L., et al. Long-term in vivo recording of circadian rhythms in brains of freely moving mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, 4276-4281 (2018).
