절연 및 Extracellular 소포 특성 성인 Schistosoma 나무 에서
Summary
여기, 선물이 성인 Schistosoma 나무에서 체 외에서 배양된 매체에 extracellular 소포 (EVs) 격리를 설명 하는 프로토콜.
Abstract
Extracellular 소포 (EVs)는 막 소포 세포 외 microenvironment로 셀의 다양 한 발표. EVs는 누구의 크기 범위 40 1000 nm 사이 이기종 vesicles의 인구를 나타냅니다. 축적 된 증거는 EVs에 중요 한 역할 규정 호스트 병원 체 상호 작용에 표시. Schistosome EVs에 대 한 깊은 이해는 기본 schistosomiasis에 대 한 새로운 전략의 개발을 활성화 하는 schistosome-호스트 상호 작용 메커니즘에 대 한 통찰력을 제공 해야 합니다. 여기, 우리는 성인 Schistosoma 나무 (S. 머 위)에서 절연 및 EVs의 특성화에 대 한 프로토콜을 제시 하 여 EVs 함수 schistosomes에 진학 하고자 합니다. EVs 문화 매체 체 외에 상업 exosome 격리 키트와 결합 하는 원심 분리를 사용 하 여 격리 했다. 고립 된 미 나무 EVs (SjEVs) 일반적으로 100-400 nm의 직경을가지고 그리고 전송 전자 현미경 검사 법 및 서쪽 blotting에 의해 특징입니다. 염료-표시 된 SjEVs PKH67의 사용 SjEVs 받는 사람 세포에 의해 내 면화는 설명 했다. 전반적으로, 우리의 프로토콜 성인 schistosomes;에서 EVs를 격리 하기 위한 대체 방법을 제공 한다 격리 된 SjEVs 기능 분석에 적합 수 있습니다.
Introduction
Extracellular 소포 (EVs)는 작은 막 도약 소포와 다양 한 단백질, 지질, 핵 산 캡슐화의 인구. 최근 연구 보여준 EVs 셀 셀 통신에 중요 한 역할을 하 고 셀 개발, 면역 조절, 신생, 세포 마이그레이션2, 등 수많은 생리 적 프로세스의 규칙에 관련 된 3,,45. 증거를 축적 EVs, exosomes, 그리고 그들의 miRNA 화물 순환 특정 질병6의 잠재적인 생체 나타냅니다 나타냅니다.
여러 가지 원생 동물 Trichomonas vaginalis, Trypanosoma cruzi, 등 Leishmania spp., EVs;를 분 비 수 표시 되었습니다 helminths 발견 되었습니다 또한7호스트 생활에 EVs를 분 비. 기생 EVs pathogenicity8, 감염과 면역 규칙9의 유지 보수에 포함 될 표시 되었습니다. 최근 두 Schistosoma mansoni (S. mansoni) 10,11 schistosomes에서 공부와 미 나무12 성인 schistosomes 분 수 있는 exosome 같은 소포 비 표명 특정 생물 학적 과정의 기능 규정에 참여.
날짜 하려면, 여러 가지 방법은 extracellular 소포, ultracentrifugation, 외13, 폴리머 기반 시 약, 크기 배제 크로마토그래피, immunoaffinity 격리의 사용을 사용 되었습니다. 이러한 다른 방법을 그들의 자신의 이점 및 제한 사항14. 일반적으로, ultracentrifugation는 소포 격리에 대 한 표준 방법으로 간주 됩니다. 그러나,이 방법은 잠재적인 EV 집계14의 한계에서 고통.
Schistosomes에서 방법의 몇 가지 EV 격리에 대 한 보고 되었습니다: ultracentrifugation11,,1210 와 여러 단계 (달걀16, 상업 EV 격리 키트16 를 사용 하 여 포함 됩니다 schistosomula11, 성인 schistosomes10,,1217). Microvesicles 천 나노미터 몇 백 나노미터 크기의 넓은 범위는, 그 주어진 우리 벤치 원심 분리기, 한, 그리고 분리에서 EVs 상업 킷은 절연을 사용 하 여 결합 하는 대체 방법 개발 성인 Schistosoma 나무. 격리 된 EVs는 일반적으로 100-400 nm의 직경을 소유 하 고 성공적으로 받는 세포에 의해 내 면화 했다.
Protocol
Representative Results
Discussion
EVs에 대 한 최근 연구는 schistosome EVs 호스트 병원 체 상호 작용3,9,,1216에 중요 한 역할을 설명 했다. 추가 주소에 그들의 규정 하는 기능 필수적 이다 schistosomes에서 EVs를 분리. 여기, 우리 SjEV 절연을 위한 다른 방법을 설명합니다. 이 메서드 생성, SjEVs의 넓은 범위 크기 100에서 400 nm nm, 성인 미 나무</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는, 일부 또는 전체, 국가 자연 과학 재단의 중국 (31472187 및 31672550) 및 농업 과학, 농업 과학의 중국 아카데미의 기술 혁신 프로그램 지원.
Materials
| Material | |||
| Total Exosome Isolation Reagent (from cell culture media) | ThermoFisher SCIENTIFIC | 4478359 | For isolating S. japonicum extracellular vesicles |
| PKH67 | Sigma-aldrich | MINI67 | For labeling Evs |
| RPMI 1640 Medium | ThermoFisher SCIENTIFIC | 11875119 | For parasite culture |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher SCIENTIFIC | 15140122 | |
| 0.22μm syringe filter | Merck | SLGP033RB | |
| SnakeSkin Dialysis Tubing | Thermo SCIENTIFIC | 68035 | |
| PEG8000 | Sangon Biotech | A100159 | |
| RIPA | Beyotime | P0013B | |
| EMD Millipore™ Immobilon™ Western Chemiluminescent HRP Substrate (ECL) | Fisher scientific | WBKLS0100 | |
| DAPI | Cell Signaling Technology | 4083 | |
| BCA kit | Beyotime | P0010 | |
| CD63 antibodies | Sangon Biotech | D160973-0025 | |
| PVDF | Bio-Rad | 1704273 | |
| Formvar/Carbon 400 mesh | Ted Pella | 01754-F | |
| Phosphotungstic Acid | Ted Pella | 19402 | |
| anti-mouse IgG-HRP | CWBIO | CW0102 | |
| NCTC clone 1469 cells | ATCC | ATCC® CCL-9.1™ | |
| FBS | HyClone | SV30087.02 | |
| Equipments | |||
| GE chemoluminescance imaging system | GE | ImageQuant LAS4000mini | |
| Transmission electron microscopy | Hitachi | H-7600 | |
| Milli-Q water | Milli-Q | Milli-Q Elix | |
| Eppendor Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5804R | |
| Zetasizer Nano | Malvern | Zetasizer Nano ZS | |
| Ultracentrifuge | Beckman | Optima L-100 XP Ultracentrifuge | |
| Incubator | ESCO | CCL-107B | |
| Microscope | Zeiss | Zeiss Axin Observer Z1 | |
References
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