Summary

Isolamento e caracterização de vesículas extracelulares de adultos Schistosoma japonicum

Published: May 22, 2018
doi:

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para descrever o isolamento de vesículas extracelulares (EVs) em vitro culta médio de adultos Schistosoma japonicum.

Abstract

Vesículas extracelulares (EVs) são vesículas membranosas lançadas por uma variedade de células no microambiente extracelular. SVE representa uma população de vesículas heterogêneas, cujo intervalo de tamanho entre 40 e 1.000 nm. Evidências acumuladas indicaram que EVs desempenham importantes funções reguladoras em interações patógeno-hospedeiro. Uma compreensão profunda da esquistossomíase EVs deve fornecer insights sobre os mecanismos subjacentes interações esquistossomíase-host, permitindo o desenvolvimento de novas estratégias contra a esquistossomose. Aqui, pretendemos estudar mais EVs funções em schistosomes apresentando um protocolo para o isolamento e caracterização de EVs de adultos Schistosoma japonicum (S. japonicum). SVE foram isolados em vitro o meio de cultura usando centrifugação combinada com um kit de isolamento exossomo comercial. Os isolados de S. japonicum EVs (SjEVs) normalmente possuem um diâmetro de 100-400 nm e são caracterizadas por microscopia eletrônica de transmissão e mancha ocidental. O uso de PKH67 SjEVs de tingir-etiquetados demonstrou que SjEVs são internalizados pelas células destinatários. No geral, o nosso protocolo fornece um método alternativo para isolar EVs de schistosomes adultos; o SjEVs isolado pode ser adequado para análise funcional.

Introduction

Vesículas extracelulares (EVs) são uma população de pequenas vesículas de membrana-limite encapsulado com várias proteínas, lípidos e ácidos nucleicos. Estudos recentes demonstraram que EVs desempenham um papel crucial na comunicação célula-célula e estão envolvidos na regulação de numerosos processos fisiológicos, incluindo desenvolvimento de célula, regulamento imune, angiogênese e da migração celular2, 3,4,5. Acumular evidências indica que EVs, circulando exosomes e sua carga de miRNA representa potenciais biomarcadores de determinadas doenças6.

Vários protozoários como Trichomonas vaginalis, Trypanosoma cruzie Leishmania spp., foram mostrados para ser capaz de secretar EVs; Além disso foram encontrados helmintos de secretar EVs em vivo hospeda7. EVs parasitárias foram mostrados para ser envolvido na manutenção da infecção, patogenicidade8e imune regra9. Recentes estudos em schistosomes ambos Schistosoma mansoni (S. mansoni) 10,11 e S. japonicum12 têm indicado que adultos schistosomes secretam exossomo como vesículas que podem ser envolvidos na regulamentação funcional de processos biológicos específicos.

Até à data, vários métodos têm sido utilizados para isolar vesículas extracelulares, tais como ultracentrifugação, ultrafiltração13, o uso de reagentes baseado em polímero, cromatografia de exclusão-tamanho e isolamento de immunoaffinity. Esses métodos diferentes possuem suas próprias vantagens e limitações de14. Geralmente, a ultracentrifugação é considerada o método padrão-ouro para isolamento de vesículas. No entanto, este método sofre a limitação do potencial de agregação de EV14.

Em schistosomes, foram relatados alguns métodos para isolamento de EV: Estes incluem ultracentrifugação11,12,10 e o uso de comerciais EV isolamento kit16 para vários estágios (ovos16, schistosomula11, schistosomes adulto10,12,17). Dado que aumentada é de uma vasta gama de tamanho de várias centenas de nanômetros a mil nanômetros, desenvolvemos um método alternativo que combina com o uso de centrífuga de bancada e um kit de isolamento comercial EV para isolar o SVE de ultrafiltração adultos de Schistosoma japonicum. O SVE isolado normalmente possuía um diâmetro de 100-400 nm e com êxito foram internalizado pelas células destinatários.

Protocol

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de ética local do Instituto de investigação veterinária de Shanghai, Academia Chinesa de Ciências agrárias (número de licença: SHVRIAU-14-0101). 1. cultura in Vitro de Schistosomes Nota: Schistosomes representam um risco biológico. Os trabalhadores devem usar luvas de látex vezes quando manipulação vermes, suspensões esquistossomóticos ou outros rel…

Representative Results

Para quantificar o rendimento de SjEVs isolado usando o protocolo descrito, costumávamos ensaio da proteína BCA para acessar a concentração de proteína da SjEVs isolada de adultos schistosomes 28 dias. Conforme mostrado na tabela 1, a concentração de proteína SjEV variou de 208 µ g a 250 µ g por 100 mL de meio (tabela 1). O tamanho de partícula, conforme determinado pela análise de nanopartículas de Malvern, indicou que o isolado SjEVs variou…

Discussion

Estudos recentes sobre EVs têm demonstrado que esquistossomíase que EVS desempenham um papel importante nas interações patógeno-hospedeiro3,9,12,de16. Para endereço ainda mais suas funções reguladoras, é essencial para isolar EVs de schistosomes. Aqui, descrevemos um método alternativo para SjEV isolamento. Este método produz um tamanho de ampla gama de SjEVs, de 100 nm a 400 nm, em …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este estudo foi, em parte ou no todo, suporte Nacional Natural Science Foundation da China (31472187 e 31672550) e a ciência agrícola e programa de inovação de tecnologia da Academia Chinesa de Ciências agrárias.

Materials

Material
Total Exosome Isolation Reagent (from cell culture media) ThermoFisher SCIENTIFIC 4478359 For isolating S. japonicum extracellular vesicles
PKH67 Sigma-aldrich MINI67 For labeling Evs
RPMI 1640 Medium ThermoFisher SCIENTIFIC 11875119 For parasite culture
Penicillin-Streptomycin ThermoFisher SCIENTIFIC 15140122
0.22μm syringe filter Merck SLGP033RB
SnakeSkin Dialysis Tubing Thermo SCIENTIFIC 68035
PEG8000 Sangon Biotech A100159 
RIPA Beyotime P0013B
EMD Millipore™ Immobilon™ Western Chemiluminescent HRP Substrate (ECL) Fisher scientific WBKLS0100 
DAPI Cell Signaling Technology 4083
BCA kit Beyotime P0010
CD63 antibodies Sangon Biotech D160973-0025
PVDF Bio-Rad 1704273
Formvar/Carbon 400 mesh Ted Pella 01754-F
Phosphotungstic Acid Ted Pella 19402
anti-mouse IgG-HRP CWBIO CW0102
NCTC clone 1469 cells ATCC ATCC® CCL-9.1™
FBS HyClone SV30087.02
Equipments
GE chemoluminescance imaging system GE ImageQuant LAS4000mini
Transmission electron microscopy Hitachi H-7600
Milli-Q water Milli-Q Milli-Q Elix
Eppendor Centrifuge  Eppendorf Centrifuge 5804R
Zetasizer Nano Malvern Zetasizer Nano ZS 
Ultracentrifuge Beckman Optima L-100 XP Ultracentrifuge
Incubator ESCO CCL-107B
Microscope Zeiss Zeiss Axin Observer Z1

References

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Cite This Article
Liu, J., Zhu, L., Wang, L., Chen, Y., Giri, B. R., Li, J., Cheng, G. Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum. J. Vis. Exp. (135), e57514, doi:10.3791/57514 (2018).

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