Desthiobiotin Streptavidin 선호도 중재 Mesothelioma 세포에서 RNA 상호 작용 단백질의 정화

요약

Desthiobiotin 라벨 아데닌 부자 요소 (는) 주제를 포함 하는 합성 25-뉴클레오티드 RNA oligo의 cytosolic는 바인딩 단백질의 특정 바인딩 수 있습니다.

초록

생체 외에서 RNA-풀 다운 특정 RNA 구조와 주제를 인식 하는 RNA 의무적인 단백질을 식별 하기 위한 프로토콜의 첫 번째 단계에서 아직도 크게 사용 된다. 이 RNA-풀 다운 프로토콜에서 상업적으로 합성된 RNA 프로브 biotin, desthiobiotin는 역에 streptavidin 바인딩하고 따라서 더에서 단백질의 차입을 허용 한다 RNA 가닥의 3' 말단에서의 수정 된 형태로 표시 됩니다 생리 조건입니다. RNA-desthiobiotin는 streptavidin 자석 구슬, 풀 다운 단백질 특히 관심의 RNA와 상호 작용 하는 데 사용 되는에의 상호 작용을 통해 움직일 수 있습니다. Mesothelioma 셀의 cytosolic 분수에서 비 변성 및 활성 단백질은 단백질의 원본으로 사용 됩니다. 여기 설명 하는 방법은 알려진된 RNA 의무적인 단백질 25-뉴클레오티드 (nt) 긴 RNA 프로브를 포함 하는 관심사의 순서 사이 상호 작용을 검출 하기 위하여 적용할 수 있습니다. 안정 또는 불안정 기자 벡터 분석 결과 사용 하 여 달성 하는 RNA 분자에 존재 하는 성분의 기능 특성을 완료 하는 데 유용 합니다.

서론

유전자 발현과 유전자 제품의 최종 수준 mRNA 안정성과 mRNA 번역 속도¹에 영향을 미치는 하 여 단단히 통제 수 있다. 이러한 post-transcriptional 규제 메커니즘은 타겟된 mRNA와 비 코딩 RNA 또는 RNA 바인딩 단백질 (RBPs)의 상호 작용을 통해 발휘 됩니다. 그것은 일반적으로 특정 cis을 포함 하는 (3' UTR-게놈²의 비 코딩 부분에 속하는) mRNA의 3' 번역된 영역- 트랜스에 의해 인정 되는 규제 요소 (CRE)-미르 등 RBPs 요인 행동 ³. 최고의 공부 cis-3' UTR, 내의 요소는 차례에, 그리고 특정 AU-바인딩 단백질 (AUBP)에 의해 인식 되는 아데닌 부자 요소 (는) 모티브 유도 하거나 mRNA 저하/deadenylation (감퇴는 중재) 또는 mRNA의 안정화⁴.

크기는 3' UTR calretinin의 mRNA (CALB2)은 573 bp 긴 AREsite2, bioinformatic 도구^5에의해 예측 상 상속 AU....

프로토콜

1. Cytosolic 핵 단백질 분수의 준비

1. 플레이트 4 x 10⁶ ACC-MESO-4 셀 RPMI-1640 매체에에서 성장 T150 셀 문화 술병에 보충 10 %FBS, 1 x 페니실린/스 (100 x), 그리고 2 m L-글루타민 (200 m m) m. 셀 80-90% (⁶ 셀 ~5-5.5 x 10)의 합류에 도달, 핵 및 cytosolic 분수의 단백질 추출 진행.
   참고: ACC-MESO-4 셀 라인 RIKEN 유관 센터¹¹에서 얻은 했다.
2. 중간 발음, 1 x PBS의 15 mL을 추가 하 여 셀을 세척, 기울기 접시 부드럽게 몇 번와 1 x PBS 발음. 0.25%의 3 개 mL를 추가 트립 신-EDTA와 문화 플라스 크 3 분 동안 37 ° C에서 품 어.
   참고: 분리;에 대 한 현미경 셀 보고 아직도 수돗물을 연결 하는 경우는 3의 손바닥에 대 한 플라스 크 시간.
3. 7 mL RPMI 1640 매체와 10 %FBS, 1 x 페니실린/스 (100 배), 2 mM L-글루타민 (200mm) 보충의 추가, 15 mL 튜브에 세포를 수집 하 고 5 분 동안 200 x g에 아래로 회전.
4. 중간 발음 그리고 1.5 mL 1 x P....

결과

이 실험에서 calretinin 3' UTR 은닉은 모티브의 (CALB2 3' UTR (은) 25-nt) 25-nt 긴 조각 인간 항 R (허) 단백질, 알려진된 mRNA 안정제에 특히 바인딩 되었는지 테스트 하려면 사용 되었습니다. 테스트는 요소, 25 nt RNA의 특이성 조사 CALB2 3' UTR (mtARE)는 모티브의 안정화 효과 폐지 이전 보였다는 모티브는 돌연변이 포함 하 이었다 사용된⁶. 3 RNA 프로브 28 nt 부정적인 제어 없는 요소를 포함 하는 잘 정의 된 철 반응 (없는 RNA (분노)), 철 응답 cytosolic 단백질^13,14바인딩할 알려진 RNA를 나타냅니다. 허 cytosol¹⁵mRNA 안정제로는 핵 함수 내에서 지역화 주로 이기 때문에, 핵/cy.......

토론

3' Utr는 비 코딩 게놈³에 속하고 모든 비 코딩 RNAs 단백질⁷그들의 기능 발휘 하기 위하여 작용할 수 있습니다. 포유류 게놈 복사할 퍼지 수를 발견 하 고 긴 noncoding RNAs¹⁶의 상당 부분을 생산,이 긴 noncoding RNAs로 상호 작용 하는 유전자 발현 조절에 작동 입증 증거를 신흥 개장 하는 chromatin 단지¹⁷. 이 정보는 RNA-풀 다운 분석 결과 이용 하 여 얻었다. 따라서, 특정 RNA의 인터 해독 하려면 첫 번째 단계 수 풀 다운 RNA 등 생체 외에서 생 화 확 적인 분석 수행 간단 있습니다.

메모의 시퀀스 모티브 뿐만 아니라 RNA의 이차 구조 역할을 중요 한 RNA 기능에 그들은 필수적인 단백질 상호 작용 도메인을 형성 한다. 이차 구조 생리에 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
NE-PER 핵 및 세포질 추출 키트	Thermo Fisher Scientific	78833
피어스 프로테아제 억제제 정제, EDTA-free	Thermo Fisher Scientific	A32965
피어스 BCA 단백질 분석 키트	써모 피셔 사이언티픽	23225
피어스 자기 RNA-단백질 풀다운 키트	Thermo Fisher Scientific	20164	마그네틱 비드가 포함되어 있으므로 키트를 4°C에서 보관해야 합니다. C
피어싱 RNA 3' 엔드 데스티오비오티닐화 키트	Thermo Fisher Scientific	20163	이 키트는 "Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit"의 일부이며 -20°C에서 보관해야 합니다. C는 풀다운 키트(4 ° C)를 참조하십시오.
DynaMag-2,  자기 스탠드	Thermo Fisher Scientific	12321D
Anti - HuR (MOUSE) 단클론 항체	Thermo Fisher Scientific	-	이 항체는 Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit에 포함되어 있습니다. - 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - rabbit anti-mouse secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS
Anti - α - tubulin (MOUSE) monoclonal antibody	Santa Cruz	8035	1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - rabbit anti-mouse secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS
Anti - PARP (RABBIT) Polyclonal antibody	Cell Signaling	9542	1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - goat anti-rabbit secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS
Anti - Mesothelin (MOUSE) 단클론 항체	Rockland	200-301-A87
2차 염소 항토끼 항체	세포 신호	7074
2차 토끼 항-마우스 항체	Sigma-Aldrich	A-9044
RPMI - 1640 중간	Sigma-Aldrich	R8758
FBS - 여과된 소 혈청	팬 Biotech	P40-37500
페니실린 - 스트렙토마이신 (100x)	시그마-알드리치	P4333
L-글루타민 용액 (200 mM)	Sigma-Aldrich	G7513
0.25% 트립신-EDTA (1x)	Gibco by Life technologies	25200-056
Mini-PROTEAN 3 Cell	Bio-Rad	1653301
Mini Protean 시스템 유리 플레이트	Bio-Rad	1653308
1.5mm 통합 스페이서가 있는 Mini-PROTEAN 스페이서 플레이트	Bio-Rad	1653312
Mini-PROTEAN 빗, 10-well, 1.5 mm, 66 µ L	Bio-Rad	1653365
Mini-PROTEAN Tetra 세포 주조 모듈	Bio-Rad	1658050
RNaseZap RNase 오염 제거 솔루션	Thermo Fisher Scientific	AM9780
Rotiphorese gel 30 - 37.5:1	Roth	3029
20% SDS 의	PanReac AppliChem	A3942
PVDF 전사막	Perkin Elmer	NEF1002	순수한 메탄올에서 1분 동안 배양한 후 2분 동안 물로 세척하여 활성화해야 합니다.
Trans-Blot SD 반건조 전사 셀	Bio-Rad	1703940
Clarity Western ECL Substrate	Bio-Rad	1705061
FusionFX  디지털 이미저	Vilber-RNA
올리고 합성	Mycrosynth AG, 스위스	-	합성 규모 - 0.04 &마이크로; mol - HPLC 정제된
소 혈청 알부민	Sigma-Aldrich	A7030
염산 (HCl) 6 M	PanReac AppliChem	182883.1211
초순수 1 M Tris, pH 7.5	Thermo Fisher Scientific	15567027
글리세롤	Thermo Fisher Scientific	17904	50% 멸균 분취량은 -20°C에서 보관해야 합니다. C
피어스 스트렙타비딘 자석 비즈	Thermo Fisher Scientific	88817	이 마그네틱 비드의 평균 직경은 1 &마이크로입니다. m (0.5 - 1.5 µ 범위; 또한, Dynabeads-M280 Streptavidin은 균질화 크기 2.8 µ의 비드입니다. m은 RNA-pulldown에도 사용되지만 정제 과정에 영향을 미칠 수 있습니다.
TEMED	Sigma-Aldrich	T9281
과황산암모늄	Sigma-Aldrich	A3678
Coomassie G-250	Applichem	A3480
알루미늄황산염-(14-18)-수화물	시그마-알드리치	368458
오르토인산	애플리켐	A0637

에는 비율로 30% 아크릴아미드 및 비사아크릴아미드 재고 용액;