Summary
نقدم هنا، بروتوكولا لقياس تسرب الأوعية الدموية الناجمة عن إدارة الأدمة من عوامل تشجيع النفاذية في الجلد مورين. يمكن استخدام هذا الأسلوب لتحديد قدرة جزيئات تشجع أو تمنع تسرب الأوعية الدموية أو دراسة الآليات الجزيئية التي تنظم نفاذية الأوعية الدموية.
Abstract
الوظيفة الأساسية للبطانة الوعائية في الكائنات الحية الفقارية هو أن تكون بمثابة حاجز بين الدم وأنسجة الجسم، حيث نفاذية البطانة لخلايا الدم وبلازما الجزيئات الكبيرة والمياه يمكن تكييفها وفقا لكل الحاجة الفسيولوجية. في بعض الأمراض، السيتوكينات، وعوامل النمو يتم الإفراج التي تستهدف حاجز غشائي عابر زيادة نفاذية الأوعية الدموية؛ ومع ذلك، قد يؤدي وجودهم المطول هايبربيرميبيليتي الأوعية الدموية المزمنة وذمة وبالتالي تضر بالانسجة. تحليل كم هو أسلوب في فيفو التي يسمح للباحثين لدراسة الأوعية الدموية هايبربيرميبيليتي عن طريق قياس الوكيل تسرب الأوعية الدموية. هنا، نحن نقدم بروتوكول مفصلة حول كيفية تنفيذ هذا الإجراء في الماوس، وهو الكائن النموذج الأكثر استخداماً في دراسة الثدييات علم وظائف الأعضاء وعلم الأمراض. ويشمل الإجراء الحقن الوريدي صبغ إيفانز الأزرق لتسمية الزلال المتداولة التي تليها الحقن داخل الأدمة متعددة العوامل الحافزة النفاذية وحلول مراقبة المركبات إلى معارضة سطوح السفوح للماوس. ونتيجة لذلك، تسرب صبغة إيفانز الأزرق تدريجيا إلى الأدمة، حيث تتراكم ويمكن استخراج للقياس الكمي كالتسرب الناجم عن الوكيل الذي يحفز نفاذية مقارنة بالسيارة. والرزن كم يمكن أن يؤديها في نوع البرية أو وراثيا تعديل نماذج الماوس وقد تكون جنبا إلى جنب مع إدارة المخدرات بدراسة الآليات الجزيئية التي تنظم نفاذية الأوعية الدموية، وتحديد عوامل/أهداف قادرة على حمل أو حجب هايبربيرميبيليتي.
Introduction
تتمثل المهمة الرئيسية لنظام القلب والأوعية الدموية تمكين نقل الغازات والمواد الغذائية ومنتجات النفايات بين الدورة الدموية والأنسجة في جميع الأجهزة. الأوعية الدموية بالمستويات الخاصة بالجهاز من نفاذية القاعدية للسماح بمثل هذه المبادلات1. على سبيل المثال، الأوعية الدموية في الكلي نفاذية عالية، في حين يشكل حاجز الدم في الدماغ ضيق، درجة عالية لا يمكن اختراقها واجهة2،3،4. توفير حاجز مادي بين الدورة الدموية والأنسجة الكامنة وراء الخلايا البطانية التي تشكل البطانة الداخلية للأوعية الدموية وتنظيم نفاذية الأوعية الدموية بصورة خاصة بالجهاز. ومع ذلك، بعض المحفزات تسبب انهيار جزئي حاجز غشائي لزيادة التسرب السوائل من الدورة الدموية في إينتيرستيتيوم أعلى المستويات القاعدية1. هذه هايبربيرميبيليتي هو الملاحظة، على سبيل المثال، في مواقع الصدمات الأنسجة، التهاب، في الأورام، في أثناء الانتان، في العيون مع المرض نيوفاسكولار أو في الدماغ والقلب، وعندما يحدث الاسكيمية الأنسجة نتيجة السكتة الدماغية أو احتشاء عضلة القلب، على التوالي 5 , 6 , 7 , 8-عند ارتفاع مزمن، هايبربيرميبيليتي يؤدي إلى وذمة، الذي بدوره يسبب تلف الأنسجة، مثل فقدان الرؤية في العين المرض9. وهكذا، النمذجة استجابة الأوعية الدموية هايبربيرميبيليتي المرغوب فيه لفهم الآليات التي تزيد من نفاذية بطانية واختبار فعالية وكلاء مصممة لتحول دون ذلك.
والرزن كم هو تقنية راسخة وشائعة الاستخدام وبسيطة نسبيا أن التدابير تسرب الأوعية الدموية في الجسم الحي كمقياس بديل للأوعية الدموية هايبربيرميبيليتي. على الرغم من أنه لم يأخذ في الاعتبار العوامل التي قد تزيد من تسرب الأوعية الدموية مستقلة عن التنظيم حاجز غشائي، مثل ضغط الدم أو تدفق الدم، مما يضاعف من مقايسة كم عموما يعتقد أن توفر طريقة يمكن الاعتماد عليها لتقييم النشاط تحوير نفاذية المواد وتحديد الوسطاء إرسال الإشارات التي تروج لنشاطها. وبناء على ذلك، مقايسة كم كانت جزءا لا يتجزأ من العديد من الدراسات التي حددت وسطاء هايبربيرميبيليتي الأوعية الدموية وآلياتها لعمل10،11،،من1213، 14،15، مثل عامل نمو الأوعية الدموية غشائي VEGF-أ التي كانت حددت أصلاً كعامل نفاذية الأوعية الدموية فانواتو16.
وضعت أصلاً بميل وميل دراسة نفاذية الأوعية الدموية في خنازير غينيا17، مقايسة كان بعد ذلك تتكيف مع استخدام الفئران، التي هي الآن الكائن النموذج المفضل توضيح الآليات الجزيئية من نفاذية الأوعية الدموية اللائحة بسبب ملاءمتها رائعة للتلاعب بالجينات. بإيجاز، عن طريق الوريد صبغة زرقاء إيفانز حقن الفئران الكبار والسماح بالتنقل لمدة 30 دقيقة (الشكل 1). ثم يتم حقن عوامل حفز نفاذية مقابل التحكم بالسيارة إينتراديرمالي في مواقع متعددة في معارضة سطوح السفوح الماوس للحث على تسرب الأوعية الدموية (الشكل 1). ونتيجة لذلك، الزلال ربط إيفانز صبغة زرقاء اكسترافاساتيس ويتراكم في الأدمة (الشكل 1). بعد إعدام إنسانية الماوس، يتم استخراج الأزرق إيفانز من الأدمة ومستوى تسرب الأوعية الدموية تحسب كنسبة اختبار مادة للمركبات-الناجمة عن الكثافة البصرية (الشكل 2).
Protocol
جميع أعمال الحيوان أجريت بعد "وزارة الداخلية في المملكة المتحدة"، والمبادئ التوجيهية المؤسسية "الرفق بالحيوان"، وهيئة المراجعة الأخلاقية (أويرب).
1. إعداد الماوس
ملاحظة: إجراء التجارب التي أجريت على الفئران الكبار من السن، ما لا يقل عن 8 أسابيع تصل إلى 6 أشهر من العمر. من أجل إثبات إمكانية تكرار نتائج التقنية وتوقيت متسقة لكل خطوة من هذا الإجراء بين الحيوانات المختلفة، استخدام الحد ني 2 والحد الأقصى للفئران 6 لكل دورة تجريبية. لتقييم تأثير طفرة في مادة يحفز النفاذية في الفئران المعدلة وراثيا، من الناحية المثالية، استخدام الفئران متحولة 2 وضوابط ليتيرماتي 2 كل التجارب.
- 24 ساعة قبل تنشيط الأوعية الدموية هايبربيرميبيليتي، تخدير الفئران تستخدم مناسبة استنشاق مخدر مثل إيسوفلوراني. استخدام إيسوفلوراني 3% لتحريض التخدير حتى المعاكسة رايتينج المفقودة والماوس لا يستجيب للمؤثرات الخارجية. استخدام isoflurane 1.5% للمحافظة على التخدير (ضمان أن الماوس بمعدلات ثابتة الجهاز التنفسي). تحت التخدير، يحلق بعناية كلا الجناحين من كل الماوس مع ماكينة حلاقة كهربائية، تجنب الأضرار التي تلحق بالجلد.
ملاحظة: يتم استخدام التخدير لتفادي تسبب الإجهاد للحيوان وتقليل حركة أثناء الحلاقة، مما قد يتسبب في تلف الجلد. - العودة الماوس حلق إلى قفصة المنزل. لذكور الفئران، ضع كل أنثى في قفص حدة بعد التخدير الإنعاش لمنع القتال، وذلك، يضر الجلد. للفئران الإناث، إعادتها في مجموعة إلى القفص المنزل.
ملاحظة: إذا كان القتال وسلوك الملاحظ بين ذكور الفئران في القفص، قبل الإجراء، فصلها في أقفاص فردية لمدة 3 أيام قبل التجربة للسماح باحتمال تلف الجلد للشفاء. - مراقبة الفئران حتى استرداد وعيه (عادة في غضون بضع ثوان)، والتحرك في جميع أنحاء القفص (عادة في غضون 1 دقيقة).
2-الحقن إيفانز أزرق صبغ
- تدفق الصفحي مجلس الوزراء، إعداد الحلول العقيمة منفصلة ماليات pyrilamine مثبطات الهيستامين (4 ميكروغرام/ميليلتر في المحلول الملحي 0.9 في المائة)، وصبغ إيفانز الأزرق (1% w/v في المحلول الملحي 0.9 ٪). تعقيم بتمرير الحلول من خلال عامل تصفية 22 ميكرومتر.
- استخدام المحاقن معقمة 1 مل مع 30 غ إبرة حقن إينترابيريتونيلي كل الماوس مع 10 ميليلتر pyrilamine ماليات الحل/غرام من وزن الجسم (الشكل 1A). للقيام بالقفا الأولى، حقن، الماوس وثم إمالة الرأس ويتجه نحو الأرض والبطن تتجه صعودا. حقن في الأرباع السفلي من البطن بعيداً عن خط الوسط تجنب الاصطدام بالمثانة.
ملاحظة: وزن الفئران بين 8 أسابيع و 6 أشهر من العمر عادة ما يتراوح بين 15 و 30 غ. بيريلاميني ماليات سوف تحول دون الإفراج عن الهيستامين الذاتية، مما يعزز وإلا تسرب الأوعية الدموية مستقلة عن الوكيل لفحصها. - ضع الماوس في غرفة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لتعزيز توسع الأوعية. بدلاً من ذلك، استخدام مصباح حرارة مناسبة تركز على الذيل لتعزيز توسع الأوعية إذا كان مسموح باستخدام مصباح الحرارة بالمبادئ التوجيهية الأخلاقية المحلية.
- تحريك الماوس واحدة في وقت واحد إلى ريسترينير ماوس وفرك الذيل مع الإيثانول 70% تنظيف منطقة الحقن، ومواصلة تعزيز توسع الأوعية.
- استخدام المحاقن معقمة 1 مل بإبرة ز 30 لإدارة 100 ميليلتر إيفانز الأزرق صبغة عن طريق الوريد عن طريق الوريد الذيل (الشكل 1B). تطبيق الضغط على موقع الحقن بعقد الذيل بين إصبع والإبهام منع النزيف فورا.
ملاحظة: يمكن تحسين التصور الوريد ذيل بتوجيه lamplight إلى منطقة الحقن. يمكن الاطلاع على المزيد من التفاصيل حول إجراء حقن الوريد الوريد ذيل الماوس في بروتوكول منشورة18. - تسمح الصبغة تعميم لمدة 30 دقيقة.
3-تحفيز الأوعية الدموية هايبربيرميبيليتي
- استخدام الحلول العقيمة في تدفق الصفحي مجلس الوزراء، يضعف عامل نفاذية يحفز الاهتمام إلى تركيز يسمح الجرعة النهائية التي ستلقى في حجم 20 ميليلتر.
ملاحظة: في التجربة المثال المبين في الشكل 1-2 الشكل، يتم استخدام فيجفا لتحفيز الأوعية الدموية هايبربيرميبيليتي بتركيز 2.5 نانوغرام/ميليلتر في برنامج تلفزيوني، تسفر عن جرعة إجمالية 50 نانوغرام، وبرنامج تلفزيوني كعنصر تحكم سيارة. - تحميل عامل نفاذية يحفز الاهتمام ومراقبة المركبات إلى 2 منفصلة العقيمة 300 ميليلتر الحقن بإبرة ز 31. تحميل حل كاف لحقن كل الماوس مع 20 ميليلتر من الحل في ثلاث نسخ (أي إعداد ميليلتر 60 عامل ومركبة في الماوس، بالإضافة إلى الحجم الإضافي لحساب حجم الإبرة للميت).
- تخدير الماوس أول اختبار مع إيسوفلوراني (3% لتحريض التخدير حتى الاستقامة العاكسة يتم فقدان والماوس لا يستجيب للمؤثرات الخارجية، و 1.5% للصيانة التخدير، والتأكد من أن الماوس بمعدلات ثابتة الجهاز التنفسي).
- إينتراديرمالي حقن 20 ميليلتر من عامل نفاذية تعزيز الجناح الماوس (الشكل 1). تأكد من أن الإبرة بزاوية 15 درجة للجلد. التحقق من تكوين فقاعة أثيرت داخل الجلد والذي يشير إلى حقنه ناجحة. تكرار الحقن داخل الأدمة في مواقع إضافية 2، أقل 1 سم عن بعضها البعض.
- تشغيل الماوس لتعرض في الجناح الثاني وكرر ثلاث حقن مع الحل أداة التحكم. سجل في ورقة الموقف لكل موقع الحقن لتسهيل التعرف عليها لجمع عينات الجلد اللاحقة.
ملاحظة: التعامل مع الجلد الماوس مع توخي الحذر في هذه المرحلة؛ على سبيل المثال، تجنب معسر الجلد عند إجراء الحقن داخل الأدمة. - العودة الماوس حقن إلى قفصة المنزل ورصد الماوس حتى يستعيد وعيه (عادة في غضون بضع ثوان)، ويسير بالقرب من القفص.
- بينما يتعافى أول ماوس، فورا كرر الخطوات 3-3 و 3.5 مع الماوس الثاني، وهلم جرا (ما يصل إلى 6 من الفئران أقصى كل دورة). الاحتفاظ بسجل للوقت تم حقن كل الماوس لضبط الوقت للمضي قدما إلى الخطوة التالية.
4-التحديد الكمي للأزرق إيفانز المتراكمة داخل الأدمة
- إعدام كل الماوس بخلع عنق الرحم 20 دقيقة بعد أن تلقت الحقن داخل الأدمة، التقيد بنفس الترتيب الذي تم حقن الفئران.
ملاحظة: قد تختلف مدة تسرب الأوعية الدموية وفقا للوكيل الذي يحفز نفاذية المستخدمة، و، ولذلك، قد تحتاج الوقت بين الحقن داخل الأدمة وإعدام الأمثل. - مكان كل أعدمت الماوس على ظهره ودبوس قدميها على لوحة فلين ملفوفة منديل نظيف (الشكل 1).
- باستخدام مقص غير حادة، جعل شق عمودي لحوالي 3-4 سم من أسفل البطن يصل إلى الصدر الفأر الميت. مع الملقط ومشرط، ندف بعيداً الجلد من كلا الجناحين لتكشف عن الجانب الداخلي من الأدمة ومواقع لتراكم إيفانز الأزرق (الشكل 1E). دبوس أسفل الجلد فضفاضة وإزالة الدهون من المناطق المحيطة بموقع التسرب مع مشرط. إذا لزم الأمر، تأخذ صورة تمثيلية لإثبات حجم التسرب إيفانز زرقاء في الجلد.
- استخدام الملقط ومشرط، حقن مناطق الجلد المكوس تتألف من الصبغة الزرقاء إيفانز تسربت لكل موقع مع عامل يحفز النفاذية أو مركبة.
ملاحظة: العناية بالمكوس المناطق وبالمثل الحجم من الجلد للتأكد من أنه، في 4.7 الخطوة اللاحقة، سوف تمتز جزء مماثل لحجم ميثلامين بكل عينة الجلد، السماح للصبغة المستخرجة أن تضعف في كمية مماثلة من ميثلامين المتبقية . خريطة حقنه المسجلة في الخطوة 3، 5 سوف تساعد على تحديد المنطقة لأن اقتطعت. - ضع كل عينة في أنبوب 1.5 مل ووصفتها بأنها تبعاً لذلك، التأكد من أن كل عينة تقع في الجزء السفلي من الأنبوب. تخزين العينات في-20 درجة مئوية إلى استخدامها مرة أخرى. إذا كانت المعالجة فورا، اتبع الخطوات التالية.
- جاف عينات الجلد بين عشية وضحاها بوضع أنابيب مفتوحة في فرن أو في البئر لكتلة التدفئة في 55 درجة مئوية.
- لاستخراج الصبغة الزرقاء إيفانز، إضافة 250 ميليلتر من ميثلامين منزوع للعينات في غطاء دخان، وإغلاق الأنابيب. تأكد من عينات الجلد مشمولة في ميثلامين واحتضان بين عشية وضحاها في فرن أو كتلة تدفئة في 55 درجة مئوية.
- الطرد المركزي عينات في benchtop أجهزة الطرد مركزي بالسرعة القصوى (> 10,000 x ز) لمدة 40 دقيقة.
- في غطاء دخان، نقل 100 ميليلتر من المادة طافية المحتوية على صبغ من كل عينة في بئر منفصلة من صفيحة 96-جيدا أسفل شفافة، شقة (الشكل 2A).
- مقياس ذروة امتصاص إيفانز الأزرق في 620 نانومتر بقراءة مرجع من 740 نانومتر على جهاز المطياف الضوئي.
ملاحظة: 620 نانومتر هو امتصاص الذروة من إيفانز الأزرق، بينما 740 نانومتر لا تمتصه الأزرق إيفانز ويتصرف كموجة إشارة. - متوسط القراءات امتصاص ثلاث حقن من نفس الوكيل أو مركبة لكل الماوس لمراعاة التغير التقني (الشكل 2).
- حساب الفرق إضعاف القراءات من عامل يحفز نفاذية مقابل مراقبة المركبات (الشكل 2).
Representative Results
قمنا باستخدام مقايسة ميلا لتقييم قدرة VEGF-أ للحث على تسرب الأوعية الدموية بالنسبة إلى مراقبة المركبات (PBS) في فئران C57/Bl6 wildtype. وهنا نعرض تجربة ممثل باستخدام الفئران wildtype حفزت مع حقن داخل الأدمة من 20 ميليلتر محلول يحتوي على 50 نانوغرام فيجف-a في برنامج تلفزيوني أو برنامج تلفزيوني المركبة فقط. زيادة واضحة في تسرب صبغة زرقاء إيفانز في عينات الجلد حقن VEGF-أ مقارنة ببرنامج تلفزيوني كان الظاهر في الموقع (الشكل 1E) وبعد استخراج الصبغة في ميثلامين (الشكل 2A). التحديد الكمي لتجارب متعددة ويوضح أن 50 نانوغرام من VEGF-أ إلى حد كبير يدفع أكثر إيفانز التسرب الأزرق من برنامج تلفزيوني وحدها (الشكل 2)، بمتوسط زيادة 3-fold في تسرب الأوعية الدموية مقارنة بالمركبات (الشكل 2).
رقم 1: تنظيم دورات تعريفية لتسرب الأوعية الدموية في مقايسة كم- التمثيل التخطيطي (لوحات أعلى) والصور المقابلة (الألواح السفلي) من خطوات متسلسلة عند إجراء التحليل كم في الماوس. (أ) بيريلاميني ماليات يتم حقن إينترابيريتونيلي لمنع إطلاق سراح الهيستامين الذاتية 10 إلى 30 دقيقة قبل الحقن الوريدي (ب) % 1 100 ميليلتر الوريد إيفانز الأزرق في الذيل الماوس. هو الناجم عن التسرب (ج) 30 دقيقة في وقت لاحق، الأوعية الدموية بالحقن داخل الأدمة من العامل (50 نانوغرام من VEGF-أ؛ أخضر دوائر) مقابل مراقبة المركبات (برنامج تلفزيوني؛ دوائر بيضاء). (د، ه) للوصول إلى مواقع لتراكم إيفانز الأزرق، الماوس تخلصت 20 دقيقة بعد الحقن داخل الأدمة والجلد من كلا الجناحين تشريح وتمركزها. القائمة: داخل؛ رابعا: عن طريق الحقن الوريدي؛ الهوية: الأدمة؛ تغيير حجم أشرطة، 1 سم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: القياس الكمي لتسرب الأوعية الدموية في مقايسة كم- إيفانز (A) يتم استخراج الصبغة الزرقاء في ميثلامين من عينات الجلد التي تم الحصول عليها من كل الحقن داخل الأدمة في الشكل 1 ، وتحميلها في لوحة 96-جيدا لامتصاص القراءة مع جهاز المطياف الضوئي. (ب، ج) تمثيل رسومي لقراءات امتصاص من تجارب متعددة برسم أما القيم (ب) امتصاص تطبيع (الكثافة البصرية، OD) كل عامل يحفز النفاذية (VEGF-أ؛ والظلام الأخضر الدوائر) والمركبات (برنامج تلفزيوني؛ رمادي الدوائر)، أو (ج) إضعاف تغيير في التطوير التنظيمي للوكيل مقابل مركبة (أشرطة الخطأ: وزارة شؤون المرأة). وبلغ متوسط قراءات امتصاص PBS ثلاث وعينات VEGF-أ هو مبين في (أ) وكما هو موضح في (ب، ج) دوائر بيضاء أو خضراء، على التوالي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Discussion
منذ الوصف الأولى في عام 195217، وفرت المقايسة ميل الباحثين مع أسلوب نسبيا سريعة وبسيطة وموثوق بها لدراسة الآليات الجزيئية للأوعية الدموية هايبربيرميبيليتي. على سبيل المثال، قد استخدمت مقايسة ميلا لاختبار قدرة أو قوتها من عوامل مختلفة لحمل هايبربيرميبيليتي19،،من2021 أو لاختبار مدى فعالية هايبربيرميبيليتي حظر وكلاء8 ،،من2223. وكمثال آخر، قد تم اختبار العوامل التي تحفز نفاذية الأوعية الدموية في الفئران المعدلة وراثيا وضوابطها ليتيرماتي لتحديد متطلبات مستقبلات محددة وإشارة ترانسدوسينج البروتينات ليجند المستحثة هايبربيرميبيليتي الردود10،11،12،13،،من1415،،من2023. عدة إصدارات معدلة للمقايسة كم منذ ذلك الحين قد استخدمت، على سبيل المثال فيما يتعلق بالتتبع المستخدمة. وهكذا، "الأزرق إيفانز" قد تم استبداله في بعض الدراسات مع الأسفار المسمى ديكسترانس من أحجام مختلفة أو الجزئي المجالات الخرز الصغير11،13.
والميزة الرئيسية لتحليل كم عبر فحوصات أخرى للتحقيق في آليات هايبربيرميبيليتي الأوعية الدموية هو أنه من السهل نسبيا لأداء ولا تتطلب معدات باهظة الثمن. وعلاوة على ذلك، في فيفو تقنية، هذا التحليل نماذج تسرب الأوعية الدموية في سياق الأوعية الدموية سليمة، كما تعارض قياس التسرب من خلال في المختبر فحوصات مثل كذلك عبر فحوصات التمويه أو عبر المقاومة الكهربائية غشائي ( فحوصات طير)، التي تركز، حصرا، على أحادي الطبقة غشائي. البديلة في فيفو فحوصات للأوعية الدموية هايبربيرميبيليتي قد تختلف المقايسة كم هو موضح هنا باستخدام مسار تسليم مختلفة للوكيل الذي يحفز هايبربيرميبيليتي أو من خلال تحليل تسرب الأوعية الدموية في مواقع مختلفة، مثال على طريق التسليم الجهازية وكيلاً عن طريق الوريد الذيل متبوعاً بفحص تسرب الأوعية الدموية في الرئة أو القصبة الهوائية11،،من1315. واحد الحد من مقايسة كم هو أن الحقن داخل الأدمة لبعض الوكلاء، من حيث المبدأ، تؤثر أيضا في ضغط الدم وتدفق بالإضافة إلى تعطيل حاجز غشائي و، وبالتالي، تؤثر نفاذية الأوعية الدموية غير مباشرة أيضا. ومع ذلك، مؤخرا قد تبين هذا التحليل لقياس نفاذية الأوعية الدموية الناجمة عن VEGF-بمعزل عن تأثيرات على ضغط الدم النظامية15. قيد آخر للمقايسة كم أن أسرة الأوعية الدموية في الأنسجة المختلفة قد تستجيب بشكل مختلف عوامل تعزيز النفاذية، والنتائج التي تم الحصول عليها مع مقايسة كم في الجلد، ولذلك لا يجوز الممثل، على سبيل المثال، لما يحدث في الرئة أو الدماغ.
قد تؤثر على عمر الحيوان ووزنه التسرب لوحظت في مقايسة كم. لتقليل تأثير هذه المتغيرات، الباحثين يجب استخدام ليتيرماتيس أو المثل الحجم والذين تتراوح أعمارهم بين الفئران كعناصر تحكم. عند تقييم طفرات الماوس لجين معين من الفائدة، يجب أن يتم إنشاء الفئران عن طريق متخالف مقابل تربية متخالف ليتيرماتيس الاستراتيجية و wildtype المستخدمة كعناصر تحكم. وعلاوة على ذلك، فإنه من المستحسن استخدام المسكنات الغاز عكسها بسرعة، مثل إيسوفلوراني، لتجنب تضيق الأوعية، الذي وصف لبعض المخدرات مخدر تدار عن طريق الحقن الحقن24،25. حقن صبغة زرقاء إيفانز الوريد الأفقي ذيل الماوس هو خطوة حاسمة في هذا البروتوكول، ويمكن أن تؤثر إلى حد كبير على النوعية من التجربة والبيانات. وبالتالي، يجب أن يكون الباحثين المختصة في القيام بحقن الوريد الذيل وسوف المحتمل أن تحتاج إلى خبرة سابقة أو الممارسة قبل بداية الاعتداء كم تجربة. وبدلاً من ذلك، يمكن استخدام الباحثين طرق أخرى عن طريق الحقن الوريدي لتسليم إيفانز الأزرق، مثل حقن الرجعية-المداري إذا كانوا ذوي الخبرة معها. الحقن داخل الأدمة لتعزيز نفاذية الحلول يمكن أن يسبب الضرر عامل مستقل للجلد. ولذلك، الحقن داخل الأدمة لا ينبغي أن تتجاوز 20 ميليلتر في وحدة التخزين، وينبغي دائماً نفذت حضور مثبطات الهيستامين وتطبيع لحقن مراقبة المركبات.
استخدمت مقايسة كم بالعديد من الباحثين لتقييم مكونات VEGF، مما يشير إلى المسار، على سبيل المثال، سبب نفاذية الأوعية الدموية التي يسببها A VEGF يسبب الاستسقاء في مرضى السرطان16 وإعاقة الرؤية وذمة في نيوفاسكولار عدة أمراض العين7. وهكذا، نحن وآخرون قد استخدمت مقايسة كم مقارنة VEGF-أ المستحث تسرب الأوعية الدموية في الفئران التي تم تعديلها وراثيا تفتقر إلى عناصر محددة VEGF-أ إشارات تتالي12،،من1314، 15 , 20 , 23-كشفت لنا الدراسة الأخيرة باستخدام هذا النهج أن إشارات isoform VEGF-أ المرضية الرئيسية، VEGF165، من خلال مجموعة معقدة من VEGFR2 و NRP1، الذي يعزز المجال هيولى NRP1 تفعيل وساطة كيناز ABL مؤنزم الأسرة SRC أن تثير استجابة هايبربيرميبيليتي14. فيجفا أيضا تشجع نمو الأوعية الدموية ويمكن، لذلك، استخدام علاجية لاستعادة تدفق الدم إلى الأنسجة الدماغية إذا أعاقت أنشطتها هايبربيرميبيليتي يمكن أن تكون على وجه التحديد. البحث توضيح الآلية الجزيئية التي يرسم الاستجابات VEGF-أ لخلايا بطانية الأوعية الدموية نحو هايبربيرميبيليتي الأوعية الدموية ولذلك، ربما، تحديد المسارات التي يمكن التلاعب بها بصورة انتقائية تمنع المرضية وذمة VEGF-بفعل في الأمراض، مثل السرطان أو أمراض العيون الدماغية. ولا شك أن ستواصل المقايسة كم أن تكون طريقة مفيدة لتدعيم هذه وأنواع أخرى كثيرة من الدراسات الفنية لتوضيح المنظمين الجزيئية والمستجيبة للأوعية الدموية هايبربيرميبيليتي.
Disclosures
الكتاب قد لا المصالح المتضاربة تعلن.
Acknowledgments
ونحن نشكر لورا دينتي، فالنتينا Senatore وموظفي "وحدة الموارد البيولوجية" في "معهد UCL لطب العيون" للمساعدة في تربية الماوس وكاري كميل للدعم التقني. وأيد هذا العمل منحة "مجلس البحوث الطبية" (MR/N011511/1) لجيم روهربيرج ومنحة "الدكتوراه مؤسسة القلب البريطانية" إلى صراخ ج. ت. (خ/13/59/30649).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pyrilamine maleate salt | Sigma-Aldrich | P5514-5G | Resuspend in PBS |
| Deionised Formamide | Sigma-Aldrich | S4117 | Use in fume cupboard |
| Microlance Needles 30g x 0.5" | BD | 305106 | |
| Sterile Plastipak 1ml Luer | BD | 309659 | |
| Sterile MicroFine syriinges 0.3 ml - 8 mm - 30G | BD | 324826 | |
| Evans blue | Sigma Aldrich | E2129 | |
| Mouse restrainer | |||
| Heat chamber | |||
| Hair clippers | |||
| Isoflurane | Merial | ap/drugs/220/96 | |
| Scalpal | |||
| Blunt scissor | |||
| Forceps | |||
| Eppendorf tubes | |||
| Heatblock | |||
| Cork board | |||
| Benchtop refrigerated centrifuge | |||
| Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor 165 | Reliatech | M30-004 |
References
- Nagy, J. A., Benjamin, L., Zeng, H. Y., Dvorak, A. M., Dvorak, H. F. Vascular permeability, vascular hyperpermeability and angiogenesis. Angiogenesis. 11, 109-119 (2008).
- Engelhardt, B. Development of the blood-brain barrier. Cell and Tissue Research. 314, 119-129 (2003).
- Ruhrberg, C. Growing and shaping the vascular tree: multiple roles for VEGF. Bioessays. 25, 1052-1060 (2003).
- Risau, W.
- Strbian, D., et al. The blood-brain barrier is continuously open for several weeks following transient focal cerebral ischemia. Neuroscience. 153, 175-181 (2008).
- Weis, S. M., Cheresh, D. A. Pathophysiological consequences of VEGF-induced vascular permeability. Nature. 437, 497-504 (2005).
- Campochiaro, P. A. Molecular pathogenesis of retinal and choroidal vascular diseases. Progress in Retinal and Eye Research. 49, 67-81 (2015).
- Aman, J., et al. Effective Treatment of Edema and Endothelial Barrier Dysfunction with Imatinib. Circulation. , 126 (2012).
- Claesson-Welsh, L.
- Schulte, D., et al. Stabilizing the VE-cadherin-catenin complex blocks leukocyte extravasation and vascular permeability. Embo Journal. 30, 4157-4170 (2011).
- Heinolainen, K., et al. VEGFR3 Modulates Vascular Permeability by Controlling VEGF/VEGFR2 Signaling. Circulation Research. 120, (2017).
- Eliceiri, B. P., et al. Selective requirement for Src kinases during VEGF-induced angiogenesis and vascular permeability. Molecular Cell. 4, 915-924 (1999).
- Sun, Z. Y., et al. VEGFR2 induces c-Src signaling and vascular permeability in vivo via the adaptor protein TSAd. Journal of Experimental Medicine. 209, 1363-1377 (2012).
- Fantin, A., et al. VEGF165-induced vascular permeability requires NRP1 for ABL-mediated SRC family kinase activation. Journal of Experimental Medicine. 214, 1049-1064 (2017).
- Li, X. J., et al. VEGFR2 pY949 signalling regulates adherens junction integrity and metastatic spread. Nat Commun. 7, (2016).
- Senger, D. R., et al. Tumor cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid. Science. 219, 983-985 (1983).
- Miles, A. A., Miles, E. M. Vascular Reactions to Histamine, Histamine-Liberator and Leukotaxine in the Skin of Guinea-Pigs. J Physiol-London. 118, 228-257 (1952).
- Radu, M., Chernoff, J. An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability. Jove-J Vis Exp. , e50062 (2013).
- Roth, L., et al. Neuropilin-1 mediates vascular permeability independently of vascular endothelial growth factor receptor-2 activation. Sci Signal. 9, (2016).
- Acevedo, L. M., Barillas, S., Weis, S. M., Gothert, J. R., Cheresh, D. A. Semaphorin 3A suppresses VEGF-mediated angiogenesis yet acts as a vascular permeability factor. Blood. 111, 2674-2680 (2008).
- Teesalu, T., Sugahara, K. N., Kotamraju, V. R., Ruoslahti, E. C-end rule peptides mediate neuropilin-1-dependent cell, vascular, and tissue penetration. P Natl Acad Sci USA. 106, 16157-16162 (2009).
- Ho, V. C., Duan, L. J., Cronin, C., Liang, B. T., Fong, G. H. Elevated Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 Abundance Contributes to Increased Angiogenesis in Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-1-Deficient Mice. Circulation. 126, (2012).
- Chislock, E. M., Pendergast, A. M. Abl Family Kinases Regulate Endothelial Barrier Function In Vitro and in Mice. PLoS ONE. 8, e85231 (2013).
- Busch, C. J., et al. Effects of ketamine on hypoxic pulmonary vasoconstriction in the isolated perfused lungs of endotoxaemic mice. Eur J Anaesth. 27, 61-66 (2010).
- Sinclair, M. D. A review of the physiological effects of alpha2-agonists related to the clinical use of medetomidine in small animal practice. Can Vet J. 44, 885-897 (2003).
