الثقافات أورجانوتيبيك ثلاثي الأبعاد للأجهزة الحسية السمعية والدهليزيه
Summary
الثقافات أورجانوتيبيك ثلاثي الأبعاد مورين utricle والقوقعة في مسح الكولاجين أنا الهلام مورفولوجيا الأنسجة الفطرية حكرا على بصريا والسماح للتحفيز الميكانيكي من خلال تكيف صلابة مصفوفة، والسماح بإيصال جينات الفيروس بوساطة.
Abstract
الأعضاء الحسية للإذن الداخلية تشكل تحديا للدراسة في الثدييات بسبب عدم إمكانية الوصول إلى التلاعب التجريبية والمراقبة البصرية. وعلاوة على ذلك، على الرغم من أن تقنيات الثقافة القائمة تسمح الاضطرابات البيوكيميائية، هذه الأساليب لا توفر وسيلة لدراسة آثار القوة الميكانيكية وتصلب الأنسجة أثناء تطوير الحواس الإذن الداخلية. هنا يصف لنا طريقة للثقافة أورجانوتيبيك ثلاثي الأبعاد utricle مورين سليمة والقوقعة أن يتغلب على هذه القيود. تقنية لتكيف صلابة مصفوفة ثلاثية الأبعاد وصفها هنا يسمح بالتلاعب بقوة مطاطا معارضة لنمو الأنسجة. ولذلك يمكن استخدام هذا الأسلوب لدراسة دور قوي ميكانيكية أثناء تطوير الإذن الداخلية. بالإضافة إلى ذلك، تسمح الثقافات إيصال الجينات بوساطة الفيروسات، التي يمكن استخدامها لإجراء التجارب على الربح والخسارة-من-وظيفة. يحتفظ هذا الأسلوب الثقافة الفطرية خلايا الشعر ودعم الخلايا، ويخدم كبديل يحتمل أن تكون متفوقة على الثقافة التقليدية ثنائية الأبعاد للحواس السمعية والدهليزيه.
Introduction
وقد تيسر دراسة معظم جوانب التنمية الجهاز الثدييات بنظم في المختبر . الآن تستخدم طريقتين الرئيسي لثقافة الدهليزية الحواس: التعويم الحر1 و ملتصقة2 الأعمال التحضيرية. كلا الأسلوبين يسمح بالتحري عن خلية الشعر الضعف3 والتجديد1،4 في المختبر. وبالإضافة إلى ذلك، لها أدوار التنموية من الدرجة5،6،7،Wnt8، وعامل نمو البشرة مستقبلات (EGFR)9،10 إشارات الشلالات في الإذن الداخلية تم إنشاء، في جزء منه، عن طريق استخدام الثقافات في المختبر من ابيثيليا الحسية. ومع ذلك، نمو الخلايا وتمايزها تخضع للرقابة، ليس فقط من خلال الإشارات التي مورفوجينس، ولكن أيضا من خلال الرموز المادية والميكانيكية مثل جهات الاتصال بين الخلايا وصلابة المصفوفة خارج الخلية، وتمتد الميكانيكية أو انقباض. دور مثل هذه المنبهات الميكانيكية صعبة التحقيق في الإذن الداخلية النامي في فيفو. وعلاوة على ذلك، أساليب التعويم الحر وملتصقة الثقافة القائمة ليست مناسبة لمثل هذه الدراسات في المختبر. هنا يصف لنا طريقة للثقافة أورجانوتيبيك ثلاثي الأبعاد في الكولاجين وأنا الهلام من صلابة متفاوتة. هذا الأسلوب إلى حد كبير يحافظ على البنية في فيفو الدهليزية و cochlear الحواس، ويسمح للتحقيق في آثار القوة الميكانيكية على النمو والتمايز11.
لأن المنبهات الميكانيكية معروفة لتنشيط الأحداث الجزيئية المتلقين للمعلومات، مثل فرس النهر مما يشير إلى مسار12،13،،من1415، من المهم أن تكون قادرة على الجمع بين التحفيز الميكانيكي مع التلاعبات البيوكيميائية والوراثية. يسمح بتسليم جينات الفيروس بوساطة الثقافة الطريقة الموضحة هنا وذلك يمكن استخدامها لدراسة الإشارات الميكانيكية والجزيئية على حد سواء خلال الإذن الداخلية التنمية11.
Protocol
Representative Results
Discussion
الإشارات الجزيئية التي تم التوسط النمو والتمايز في الإذن الداخلية أثناء تطوير دراسة مستفيضة5،،من67،،من89،10. بيد أن الأدلة التي تم الحصول عليها من النظام النموذجي أوتريكولار تشير إ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونشكر الدكتور ألف جاكوبو وسالفي ج. د. بيتيلسكي أ لمساهماتها للبحث الأصلي الذي يستند إليه هذا البروتوكول. ونشكر أيضا ياء اللاما ووكر ماكمورا للمساعدة التقنية، وتربية الحيوانات. نعترف بمنحه التدريب NIDCD T32 DC009975، منح نيدكد R01DC015530، صندوق التنمية العلاجية روبرتسون، ومؤسسة عائلة كاروسو للتمويل. وأخيراً، نعترف بدعم من معهد هاوارد هيوز الطبي، الذي هو الدكتور هدزبيث محقق.
Materials
| #10 Surgical Blades | Miltex | 4-110 | |
| #5 Forceps | Dumont | 11252-20 | |
| 100 mm Petri dish | Sigma | P5856-500EA | |
| 250 uL large orifice pipette tips | USA Scientific | 1011-8406 | |
| 30 mm glass-bottom Petri dish | Matsunami Glass USA Corporation | D35-14-1.5-U | |
| 4 well plate | Thermo Fisher Scientific | 176740 | |
| 4-Hydroxytamoxifen | Sigma | H7904 | |
| 60 mm Petri dish | Thermo Fisher Scientific | 123TS1 | |
| Acetic acid | Sigma | 537020 | |
| Ad-GFP | Vector Biolabs | 1060 | |
| Anti-GFP, chicken IgY fraction | Invitrogen | A10262 | |
| Anti-Myo7A | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| Anti-Sox2 Antibody (Y-17) | Santa Cruz | sc-17320 | |
| Bicinchoninic acid assay | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit | Thermo Fisher Scientific | C10340 | |
| Collagenase I | Gibco | 17100017 | |
| D-glucose | Sigma | G8270 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| Epidermal growth factor | Sigma | E9644 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 16140063 | |
| Fibroblast growth factor | Sigma | F5392 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Glutamine | Sigma | G8540 | |
| HBSS | Gibco | 14025092 | |
| Hemocytometer | Daigger | EF16034F | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Insulin | Sigma | I3536 | |
| Iridectomy scissors | Zepf Medical Instruments | 08-1201-10 | |
| Microinjector | Narishige | IM-6 | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | Gibco | 70011044 | |
| PBS (1X), pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| Phenol Red pH indicator | Sigma | P4633 | |
| Pure Ethanol, 200 Proof | Decon Labs | 2716 | |
| RFP antibody | ChromoTek | 5F8 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S8045 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Tabletop vortex | VWR | 97043-562 | |
| Transferrin | Sigma | T8158 | |
| Trypan blue | Sigma | T6146 |
References
- Oesterle, E. C., Tsue, T. T., Reh, T. A., Rubel, E. W. Hair-cell regeneration in organ cultures of the postnatal chicken inner ear. Hear Res. 70 (1), 85-108 (1993).
- Meyers, J. R., Corwin, J. T. Shape change controls supporting cell proliferation in lesioned mammalian balance epithelium. J Neurosci Off J Soc Neurosci. 27 (16), 4313-4325 (2007).
- Cunningham, L. L. The adult mouse utricle as an in vitro preparation for studies of ototoxic-drug-induced sensory hair cell death. Brain Res. 1091 (1), 277-281 (2006).
- Warchol, M. E., Lambert, P. R., Goldstein, B. J., Forge, A., Corwin, J. T. Regenerative proliferation in inner ear sensory epithelia from adult guinea pigs and humans. Science. 259 (5101), 1619-1622 (1993).
- Lin, V., Golub, J. S., Nguyen, T. B., Hume, C. R., Oesterle, E. C., Stone, J. S. Inhibition of Notch activity promotes nonmitotic regeneration of hair cells in the adult mouse utricles. J Neurosci Off J Soc Neurosci. 31 (43), 15329-15339 (2011).
- Wu, J., et al. Co-regulation of the Notch and Wnt signaling pathways promotes supporting cell proliferation and hair cell regeneration in mouse utricles. Sci Rep. 6, 29418 (2016).
- Chai, R., et al. Wnt signaling induces proliferation of sensory precursors in the postnatal mouse cochlea. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (21), 8167-8172 (2012).
- Wang, T., et al. Lgr5+ cells regenerate hair cells via proliferation and direct transdifferentiation in damaged neonatal mouse utricle. Nat Commun. 6, 6613 (2015).
- Doetzlhofer, A., White, P. M., Johnson, J. E., Segil, N., Groves, A. K. In vitro growth and differentiation of mammalian sensory hair cell progenitors: a requirement for EGF and periotic mesenchyme. Dev Biol. 272 (2), 432-447 (2004).
- White, P. M., Stone, J. S., Groves, A. K., Segil, N. EGFR signaling is required for regenerative proliferation in the cochlea: conservation in birds and mammals. Dev Biol. 363 (1), 191-200 (2012).
- Gnedeva, K., Jacobo, A., Salvi, J. D., Petelski, A. A., Hudspeth, A. J. Elastic force restricts growth of the murine utricle. eLife. 6, (2017).
- Aragona, M., et al. A mechanical checkpoint controls multicellular growth through YAP/TAZ regulation by actin-processing factors. Cell. 154 (5), 1047-1059 (2013).
- Dong, J., et al. Elucidation of a universal size-control mechanism in Drosophila and mammals. Cell. 130 (6), 1120-1133 (2007).
- Low, B. C., Pan, C. Q., Shivashankar, G. V., Bershadsky, A., Sudol, M., Sheetz, M. YAP/TAZ as mechanosensors and mechanotransducers in regulating organ size and tumor growth. FEBS Lett. 588 (16), 2663-2670 (2014).
- Zhao, B., et al. Inactivation of YAP oncoprotein by the Hippo pathway is involved in cell contact inhibition and tissue growth control. Genes Dev. 21 (21), 2747-2761 (2007).
- . . AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. , (2013).
- Semerci, F., et al. Lunatic fringe-mediated Notch signaling regulates adult hippocampal neural stem cell maintenance. eLife. 6, (2017).
- Tuan, R. S., Lo, C. W. Developmental biology protocols. Methods in molecular biology. , 137 (2000).
- Brandon, C. S., Voelkel-Johnson, C., May, L. A., Cunningham, L. L. Dissection of adult mouse utricle and adenovirus-mediated supporting-cell infection. J Vis Exp JoVE. (61), (2012).
- Gosset, M., Berenbaum, F., Thirion, S., Jacques, C. Primary culture and phenotyping of murine chondrocytes. Nat Protoc. 3 (8), 1253-1260 (2008).
- Landegger, L. D., et al. A synthetic AAV vector enables safe and efficient gene transfer to the mammalian inner ear. Nat Biotechnol. 35 (3), 280-284 (2017).
- Burns, J. C., et al. Reinforcement of cell junctions correlates with the absence of hair cell regeneration in mammals and its occurrence in birds. J Comp Neurol. 511 (3), 396-414 (2008).
- Wang, J., et al. Regulation of polarized extension and planar cell polarity in the cochlea by the vertebrate PCP pathway. Nat Genet. 37 (9), 980-985 (2005).
- Chacon-Heszele, M. F., Ren, D., Reynolds, A. B., Chi, F., Chen, P. Regulation of cochlear convergent extension by the vertebrate planar cell polarity pathway is dependent on p120-catenin. Dev Camb Engl. 139 (5), 968-978 (2012).
- Yamamoto, N., Okano, T., Ma, X., Adelstein, R. S., Kelley, M. W. Myosin II regulates extension, growth and patterning in the mammalian cochlear duct. Dev Camb Engl. 136 (12), 1977-1986 (2009).
- Tada, M., Heisenberg, C. -. P. Convergent extension: using collective cell migration and cell intercalation to shape embryos. Dev Camb Engl. 139 (21), 3897-3904 (2012).
