Culturas Organotypic tridimensionales de órganos sensoriales vestibulares y auditivas
Summary
Culturas organotypic tridimensional del utrículo murino y cóclea en ópticamente claro colágeno geles preservar tejido natural morfología, permiten estimulación mecánica mediante ajuste de la rigidez de la matriz y permitan de genes mediada por virus.
Abstract
Los órganos sensoriales del oído interno son desafiantes para estudiar en los mamíferos debido a su inaccesibilidad a la manipulación experimental y observación óptica. Por otra parte, aunque las técnicas de cultivo existentes permiten perturbaciones bioquímicas, estos métodos no proporcionan un medio para estudiar los efectos de fuerza mecánica y rigidez del tejido durante el desarrollo de los órganos sensoriales del oído interno. Aquí se describe un método de cultura organotypic tridimensional del utrículo murino intacto y cóclea que supera estas limitaciones. La técnica para el ajuste de una rigidez de la matriz tridimensional que se describe aquí permite la manipulación de la fuerza elástica contra crecimiento del tejido. Por lo tanto, este método puede utilizarse para estudiar el papel de las fuerzas mecánicas durante el desarrollo del oído interno. Además, las culturas permiten entrega de genes mediada por virus, que puede ser utilizada para experimentos de ganancia y pérdida de función. Este método de cultivo conserva innata de las células ciliadas y las células y sirve como una alternativa potencialmente superior a la tradicional cultura bidimensional de órganos sensoriales vestibulares y auditivos.
Introduction
El estudio de la mayoría de los aspectos del desarrollo del órgano de los mamíferos ha sido facilitado por sistemas in vitro . Ahora se utilizan dos métodos principales para el cultivo de órganos sensoriales vestibulares: flotante1 y adherente2 preparados. Ambos métodos permiten la investigación de la célula de pelo vulnerabilidades3 regeneración1,4 y in vitro. Además, el papel del desarrollo de la muesca5,67,de Wnt8y factor de crecimiento epidérmico receptor (EGFR)9,10 señalización cascadas en el oído interno tiene se ha establecido, en parte, mediante el uso de cultivos en vitro de epitelio sensorial. Sin embargo, se controlan la diferenciación y crecimiento celular, no sólo a través de la señalización por morfógenos, sino también a través de estímulos físicos y mecánicos como contactos intercelulares, la rigidez de la matriz extracelular y mecánicos de estiramiento o constricción. El papel de tales estímulos mecánicos es un desafío para investigar en el desarrollo del oído interno en vivo. Por otra parte, los métodos existentes de cultura libre-flotación y adherentes no son adecuados para estos estudios in vitro. Aquí describimos un método de cultura organotypic tridimensional de colágeno geles de rigidez variable. En gran parte, este método conserva la arquitectura en vivo de los órganos sensoriales vestibulares y cocleares y permite la investigación de los efectos de la fuerza mecánica en el crecimiento y la diferenciación11.
Debido a estímulos mecánicos son conocidos para activar eventos moleculares posteriores, como el hipopótamo señalización vía12,13,14,15, es importante ser capaz de combinar la estimulación mecánica con manipulaciones bioquímicas y genéticas. El método de cultivo que se describe aquí permite la entrega de genes mediada por virus y puede ser utilizado para el estudio de mecánicos y moleculares de señalización durante el desarrollo de oído interno11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las señales moleculares que medie crecimiento y la diferenciación en el oído interno durante el desarrollo se han estudiaron extensivamente5,6,7,8,9,10. Sin embargo, la evidencia obtenida desde el sistema utricular modelo sugiere que señales mecánicas, detectados a través de uniones celulares y la activación de la señ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Dr. A. Jacobo, Dr. J. Salvi y Petelski A. por sus contribuciones a la investigación original en que se basa este protocolo. También agradecemos a Llamas J. y W. Makmura asistencia técnica y agricultura animal. Reconocemos la beca de formación de NIDCD T32 DC009975, NIDCD conceder R01DC015530, Fondo de desarrollo terapéutico de Robertson y la Fundación de la familia Caruso para la financiación. Finalmente, reconocemos el apoyo del Instituto médico de Howard Hughes, que es un investigador Dr. Hudspeth.
Materials
| #10 Surgical Blades | Miltex | 4-110 | |
| #5 Forceps | Dumont | 11252-20 | |
| 100 mm Petri dish | Sigma | P5856-500EA | |
| 250 uL large orifice pipette tips | USA Scientific | 1011-8406 | |
| 30 mm glass-bottom Petri dish | Matsunami Glass USA Corporation | D35-14-1.5-U | |
| 4 well plate | Thermo Fisher Scientific | 176740 | |
| 4-Hydroxytamoxifen | Sigma | H7904 | |
| 60 mm Petri dish | Thermo Fisher Scientific | 123TS1 | |
| Acetic acid | Sigma | 537020 | |
| Ad-GFP | Vector Biolabs | 1060 | |
| Anti-GFP, chicken IgY fraction | Invitrogen | A10262 | |
| Anti-Myo7A | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| Anti-Sox2 Antibody (Y-17) | Santa Cruz | sc-17320 | |
| Bicinchoninic acid assay | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit | Thermo Fisher Scientific | C10340 | |
| Collagenase I | Gibco | 17100017 | |
| D-glucose | Sigma | G8270 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| Epidermal growth factor | Sigma | E9644 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 16140063 | |
| Fibroblast growth factor | Sigma | F5392 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Glutamine | Sigma | G8540 | |
| HBSS | Gibco | 14025092 | |
| Hemocytometer | Daigger | EF16034F | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Insulin | Sigma | I3536 | |
| Iridectomy scissors | Zepf Medical Instruments | 08-1201-10 | |
| Microinjector | Narishige | IM-6 | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | Gibco | 70011044 | |
| PBS (1X), pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| Phenol Red pH indicator | Sigma | P4633 | |
| Pure Ethanol, 200 Proof | Decon Labs | 2716 | |
| RFP antibody | ChromoTek | 5F8 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S8045 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Tabletop vortex | VWR | 97043-562 | |
| Transferrin | Sigma | T8158 | |
| Trypan blue | Sigma | T6146 |
References
- Oesterle, E. C., Tsue, T. T., Reh, T. A., Rubel, E. W. Hair-cell regeneration in organ cultures of the postnatal chicken inner ear. Hear Res. 70 (1), 85-108 (1993).
- Meyers, J. R., Corwin, J. T. Shape change controls supporting cell proliferation in lesioned mammalian balance epithelium. J Neurosci Off J Soc Neurosci. 27 (16), 4313-4325 (2007).
- Cunningham, L. L. The adult mouse utricle as an in vitro preparation for studies of ototoxic-drug-induced sensory hair cell death. Brain Res. 1091 (1), 277-281 (2006).
- Warchol, M. E., Lambert, P. R., Goldstein, B. J., Forge, A., Corwin, J. T. Regenerative proliferation in inner ear sensory epithelia from adult guinea pigs and humans. Science. 259 (5101), 1619-1622 (1993).
- Lin, V., Golub, J. S., Nguyen, T. B., Hume, C. R., Oesterle, E. C., Stone, J. S. Inhibition of Notch activity promotes nonmitotic regeneration of hair cells in the adult mouse utricles. J Neurosci Off J Soc Neurosci. 31 (43), 15329-15339 (2011).
- Wu, J., et al. Co-regulation of the Notch and Wnt signaling pathways promotes supporting cell proliferation and hair cell regeneration in mouse utricles. Sci Rep. 6, 29418 (2016).
- Chai, R., et al. Wnt signaling induces proliferation of sensory precursors in the postnatal mouse cochlea. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (21), 8167-8172 (2012).
- Wang, T., et al. Lgr5+ cells regenerate hair cells via proliferation and direct transdifferentiation in damaged neonatal mouse utricle. Nat Commun. 6, 6613 (2015).
- Doetzlhofer, A., White, P. M., Johnson, J. E., Segil, N., Groves, A. K. In vitro growth and differentiation of mammalian sensory hair cell progenitors: a requirement for EGF and periotic mesenchyme. Dev Biol. 272 (2), 432-447 (2004).
- White, P. M., Stone, J. S., Groves, A. K., Segil, N. EGFR signaling is required for regenerative proliferation in the cochlea: conservation in birds and mammals. Dev Biol. 363 (1), 191-200 (2012).
- Gnedeva, K., Jacobo, A., Salvi, J. D., Petelski, A. A., Hudspeth, A. J. Elastic force restricts growth of the murine utricle. eLife. 6, (2017).
- Aragona, M., et al. A mechanical checkpoint controls multicellular growth through YAP/TAZ regulation by actin-processing factors. Cell. 154 (5), 1047-1059 (2013).
- Dong, J., et al. Elucidation of a universal size-control mechanism in Drosophila and mammals. Cell. 130 (6), 1120-1133 (2007).
- Low, B. C., Pan, C. Q., Shivashankar, G. V., Bershadsky, A., Sudol, M., Sheetz, M. YAP/TAZ as mechanosensors and mechanotransducers in regulating organ size and tumor growth. FEBS Lett. 588 (16), 2663-2670 (2014).
- Zhao, B., et al. Inactivation of YAP oncoprotein by the Hippo pathway is involved in cell contact inhibition and tissue growth control. Genes Dev. 21 (21), 2747-2761 (2007).
- . . AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. , (2013).
- Semerci, F., et al. Lunatic fringe-mediated Notch signaling regulates adult hippocampal neural stem cell maintenance. eLife. 6, (2017).
- Tuan, R. S., Lo, C. W. Developmental biology protocols. Methods in molecular biology. , 137 (2000).
- Brandon, C. S., Voelkel-Johnson, C., May, L. A., Cunningham, L. L. Dissection of adult mouse utricle and adenovirus-mediated supporting-cell infection. J Vis Exp JoVE. (61), (2012).
- Gosset, M., Berenbaum, F., Thirion, S., Jacques, C. Primary culture and phenotyping of murine chondrocytes. Nat Protoc. 3 (8), 1253-1260 (2008).
- Landegger, L. D., et al. A synthetic AAV vector enables safe and efficient gene transfer to the mammalian inner ear. Nat Biotechnol. 35 (3), 280-284 (2017).
- Burns, J. C., et al. Reinforcement of cell junctions correlates with the absence of hair cell regeneration in mammals and its occurrence in birds. J Comp Neurol. 511 (3), 396-414 (2008).
- Wang, J., et al. Regulation of polarized extension and planar cell polarity in the cochlea by the vertebrate PCP pathway. Nat Genet. 37 (9), 980-985 (2005).
- Chacon-Heszele, M. F., Ren, D., Reynolds, A. B., Chi, F., Chen, P. Regulation of cochlear convergent extension by the vertebrate planar cell polarity pathway is dependent on p120-catenin. Dev Camb Engl. 139 (5), 968-978 (2012).
- Yamamoto, N., Okano, T., Ma, X., Adelstein, R. S., Kelley, M. W. Myosin II regulates extension, growth and patterning in the mammalian cochlear duct. Dev Camb Engl. 136 (12), 1977-1986 (2009).
- Tada, M., Heisenberg, C. -. P. Convergent extension: using collective cell migration and cell intercalation to shape embryos. Dev Camb Engl. 139 (21), 3897-3904 (2012).
