Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

Rafael E. Flores-Obando; Mona M. Freidin; Charles K. Abrams

doi:10.3791/57543

JoVE Journal > Neuroscience

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신경과학

Aislamiento Inmunomagnética rápida y específica de los oligodendrocitos primarios de ratón

Published: May 21, 2018

doi:

10.3791/57543

Rafael E. Flores-Obando, Mona M. Freidin, Charles K. Abrams

¹Program in Molecular and Cellular Biology,State University of New York Downstate Medical Center, ²Department of Neurology and Rehabilitation,University of Illinois at Chicago

Summary

Describimos el aislamiento Inmunomagnética de los oligodendrocitos primario de ratón, que permite el aislamiento rápido y específico de las células para el cultivo en vitro .

Abstract

El aislamiento eficiente y robusto y la cultura de los oligodendrocitos primarios (OLs) es una herramienta valiosa para el estudio en vitro del desarrollo de oligodendroglia, así como la biología de demyelinating enfermedades como la esclerosis múltiple y Enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher-como (PMLD). Aquí, presentamos un simple y método de selección para el aislamiento de Inmunomagnética de etapa tres O4⁺ las células preoligodendrocytes de crías de ratones neonatales. Desde OL inmaduro constituyen más del 80% de la materia blanca de cerebro de roedor en el día postnatal 7 (P7) este método de aislamiento no sólo asegura alto rendimiento celular, sino también el aislamiento específico de OLs ya comprometida con el linaje oligodendroglial, disminuyendo la posibilidad de aislar células contaminantes tales como astrocitos y otras células del cerebro de ratón. Este método es una modificación de las técnicas divulgado previamente y proporciona pureza de oligodendrocyte preparación superior al 80% en aproximadamente 4 horas.

Introduction

Oligodendrocitos (OLs) son las células myelinating del sistema nervioso central (SNC)¹. El aislamiento y la cultura de los oligodendrocitos primarios en un entorno fuertemente regulado es una valiosa herramienta para el estudio en vitro del desarrollo de oligodendroglia, así como la biología de enfermedades como la esclerosis múltiple^{2 desmielinizantes}. Esto requiere de un eficiente y robusto del oligodendrocyte aislamiento y cultura método³. En este estudio, aprovechó de la expresión de un marcador superficial de la célula oligodendrocyte distintivo para aplicar una técnica de aislamiento modificado que es rápida y específica.

Se han identificado cuatro diferentes etapas de maduración del oligodendrocyte, cada uno caracterizado por la expresión de marcadores de superficie celular distintiva para cada etapa del desarrollo (figura 1). Estos marcadores de superficie celular pueden ser reconocidos por anticuerpos específicos⁴^,⁵y se pueden utilizar para aislar OLs en etapas específicas. En la primera etapa, las células del precursor de oligodendrocyte (OPC) tienen la capacidad de proliferar, migrar y específicamente del factor de crecimiento derivado de plaquetas del receptor (PDGF-Rα)⁶, gangliósido A2B5, proteoglicanos NG2⁷^,⁸, polysialic ácido-de los nervios de la célula molécula de adhesión⁹ y grasos ácido proteína-7 (FABP7)¹⁰. OPC tiene morfología bipolar con pocos procesos cortos que emanan de los polos opuestos del cuerpo celular, que es característica de precursores neuronales células¹¹.

Figura 1: expresión de marcadores de superficie celular durante el desarrollo del ratón oligodendrocyte. OLs marcadores de superficie de la célula como A2B5, GalC (O1), NG2, O4 y PDGF-Rα pueden utilizarse para aislar específicamente oligodendrocitos en etapa de desarrollo específica mediante el uso de anticuerpos específicos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

En la segunda etapa, OPC dan lugar a preoligodendrocytes y expresan en la membrana celular no sólo marcadores OPC, pero también del sulfatide (un galactolipid sulfatada) reconocido por el anticuerpo O4¹²^,¹³y la proteína GPR17¹⁴, que persiste hasta la etapa de oligodendrocyte inmaduros (OL). En esta etapa, preoligodendrocytes extender procesos cortos multipolares. Preoligodendrocytes son el escenario OL principales en el día postnatal 2 (P2) en la materia blanca cerebral de rata y ratón con una menor población de inmaduros OLs¹⁵.

Durante la tercera etapa, OLs inmaduras continúan express O4, pierden la expresión de marcadores A2B5 y NG2 y comienzan a expresar galactocerebrósido C¹⁶. En esta etapa, OLs apuestan por el linaje oligodendroglial y convertirse en células post mitóticas con ramas largas ramificadas¹⁷^,¹⁸. OL inmaduro constituyen más del 80% de la materia blanca roedor en P7, y en este momento se observan las primeras células MBP⁺ ¹⁵^,¹⁹^,²⁰^,²¹. Por lo tanto, el aislamiento de OLs en P7 podría garantizar alto rendimiento celular.

En la cuarta y última etapa del desarrollo de OL, maduro OLs myelinating expresa proteínas (proteína básica de mielina (MBP), proteína del proteolípido (PLP), glicoproteína de la mielina asociada (MAG) y del myelin oligodendrocyte glicoproteína (MOG)²²^,²³ ^,²⁴^,²⁵^,²⁶. En esta etapa, madurados OLs extienden las membranas compacto forma enwrapping vainas alrededor de los axones y son capaces de myelinate. Esto coincide con la observación que en cerebro de rata y ratón, MBP⁺ células se convierten en cada vez más abundantes en la P14¹⁹^,²⁰^,²¹.

Desde el primer aislamiento de oligodendrocyte Fewster y colegas en 1967²⁷, se han implementado varios métodos para el aislamiento de OLs de roedores CNS incluyendo immunopanning²⁸^,²⁹^,³⁰, celular activado por fluorescencia (FACS) de clasificación aprovechamiento celular antígenos de superficie específicos²⁸^,³¹, centrifugación diferencial de gradiente³²^,³³^,³⁴^,³⁵y agitación método basado en la adhesión diferencial de diferentes CNS glia³⁶^,³⁷. Sin embargo, los métodos existentes de cultura tienen limitaciones, particularmente en términos de pureza, rendimiento y tiempo necesario para realizar los procedimientos³⁸. Por lo tanto, se requieren métodos más eficientes de aislamiento de oligodendrocitos.

En este trabajo presentamos una simple y método de selección para el aislamiento de Inmunomagnética de etapa tres O4⁺ las células preoligodendrocytes de crías de ratones neonatales. Este método es una modificación de las técnicas reportadas por Emery et al. ³⁹ y Dincman et al. ⁴⁰ y una pureza de la preparación de oligodendrocyte superiores al 80% en aproximadamente 4 horas.

Protocol

Los ratones utilizados en este estudio fueron atendidos según las directrices del número de protocolo de SUNY Downstate Medical Center División de laboratorio Animal recursos (DLAR) 15-10492. Nota: Oligodendrocitos primarios fueron aislados de neonatal (P5-P7-tipo C57Bl/6N) ratones. En esta etapa, OLs inmaduros constituyen más del 80% de la materia blanca roedor garantizar alto rendimiento celular. Todos los buffer y composiciones de reactivo están disponibles al final de la Tabla…

Representative Results

El propósito de este estudio fue establecer un método de aislamiento mejorado de O4+ oligodendrocitos primario de ratón que requieren la manipulación lo menos posible de las células diana. Todo el procedimiento de eutanasia de los cachorros para el revestimiento de las células en cubreobjetos toma aproximadamente 4 horas y datos presentados aquí representan tres experimentos independientes. Después de la disociación del tejido, un promedio de 4,3 ± 0,46 x 107</su…

Discussion

En esta comunicación, presentamos un método para el aislamiento eficaz de ratón inmaduro altamente purificada oligodendrocyte culturas. Comparado con protocolos previamente publicado³⁹^,⁴⁰, este método produjo una mayor pureza con un nivel mucho más bajo de astrocitos GFAP positivas y un porcentaje muy bajo de otras células no caracterizado. Es importante señalar que estos son inmaduros OLs ya comprometidos con el linaje oligodendroglial. Así, estas célul…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este estudio fue apoyado por subvenciones de la National Multiple Sclerosis Society (RG4591A1/2) y los institutos nacionales de salud (R03NS06740402). Los autores agradecen a Dr. Iván Hernández y los miembros de su laboratorio para proporcionar asesoramiento, equipamiento y espacio de laboratorio.

Materials

10ml serological pipets	Fisher Scientific	13-676-10J
10ml syringe Luer-Loc tip	BD, Becton Dickinson	309604
15ml conical tubes	Falcon	352097
24-well tissue culture plates	Falcon	353935
40µm cell strainer	Fisher Scientific	22368547
50ml conical tubes	Falcon	352098
5ml serological pipets	Fisher Scientific	13-676-10H
60mm tissue culture plates	Falcon	353002
70µm cell strainer	Fisher Scientific	22363548
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody	Invitrogen	A11001
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgM (H+L) secondary antibody	Invitrogen	A21042
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgM (H+L) secondary antibody	Invitrogen	A11008
Alexa Fluor 594 goat anti-chicken IgG (H+L) secondary antibody	Invitrogen	A11042
Anti-O4 beads- Anti-O4MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-094-543
Apo-Transferrin human	Sigma	T1147
Autofil complete bottle top filter assembly, 0.22um filter, 250ml	USA Scientific	6032-1101
Autofil complete bottle top filter assembly, 0.22um filter, 250ml	USA Scientific	6032-1102
B27 Supplement	Invitrogen	17504-044
Boric acid	Sigma	B7660
Bovine Growth Serum (BGS)	GE Healthcare Life Sciences	SH30541.03
BSA	Fisher Scientific	BP-1600-100
CNTF	Peprotech	450-50
d-Biotin	Sigma	B4639
Desoxyribonuclease I (DNAse I)	Worthington	LS002007
EDTA	Fisher Scientific	S311
Epifluorescence microscope with an Olympus DP70 camera	Olympus	Bx51
Feather disposable scalpels	Andwin Scientific	EF7281C
Forskolin	Sigma	F6886
German glass coverslips, #1 thickness, 12mm diameter round	NeuVitro	GG-12-oz
GFAP antibody	Aves	GFAP
Glucose	Fisher Scientific	D16-1
GlutaMAX	Invitrogen	35050-61
Insulin	Invitrogen	12585-014
Magnetic separator stand – MACS multistand	Miltenyi Biotec	130-042-303
Magnetic separator-MiniMACS separator	Miltenyi Biotec	130-042-302
Millex PES 0.22µm filter unit	Millipore	SLG033RS
Mounting media- Prolong Gold with DAPI	Thermo Fisher	P36930
N-acetyl-cysteine (NAC)	Sigma	A8199
Natural mouse laminin	Invitrogen	23017-015
Neurobasal Medium A	Invitrogen	10888-022
Neurotrophin-3 (NT-3)	Peprotech	450-03
NG2 antibody	Millipore	AB5320
Papain	Worthington	LS003126
PBS without Ca2⁺ and Mg2⁺	Sigma	D5652
PDGF	Peprotech	100-13A
Petri dishes	Falcon	351029
Poly-D-Lysine	Sigma	P6407
Primocin	Invivogen	ant-pm-2
Progesterone	Sigma	P8783
Putrescine	Sigma	P5780
Selection column-LS columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
Sodium Selenite	Sigma	S5261
Trace elements B	Corning	25-000-CI
Triiodothyronine (T3)	Sigma	T6397
Triton-X	Sigma	T8787
Trypan Blue Solution	Corning	25-900-CI
Tween 20	Sigma	P1379
B27NBMA			487.75 mL Neurobasal Medium A; 10 mL B27 Supplement; 1 mL Primocin; 1.25 mL Glutamax; Filter sterilize and store at 4 °C until use.
B27NBMA + 10% BGS			27 mL B27NBMA; 3 mL Bovine growth serum
CNTF solution stock (10 µg/ml; 1000X)			Order from Peprotech (450-50). Make up at 0.1 to 1 mg/ml according to Manufacturer’s instruction (may vary from lot to lot) in buffer (e.g. DPBS + 0.2% BSA). Store at -80 °C. Working solution (10 µg/ml, 1000X) 1. Make on 0.2% BSA (Fisher scientific BP-1600-100) in DPBS solution and filter sterilize. 2. Dilute master stock aliquot to 10µg/ml in sterile, chilled 0.2% BSA/DPBS. 3. Aliquot (20µl/tube) and snap freeze in liquid nitrogen. 4. Store aliquots at -80 °C.
d-Biotin stock solution (50 µg/ml; 5000X)			Resuspend d-Biotin (Sigma-B4639) in double-distilled H2O at 50 µg/ml (e.g. 2.5 mg in 50 ml of ddH2O). Resuspension might take fair amount of agitation/vortexing, or mild warming briefly at 37°C. If the d-Biotin still will not solubilize, it is fine to make up a less concentrated (e.g. 10µg/ml), and to add a higher volume to the B27NBMA (1/1000), instead of 1/5000). Store at 4°C.
DNase I stock solution			1. Dissolve at 12,500 U Deoxyribonuclease I / ml in HBSS chilled on ice. 2. Filter sterilize on ice 3. Aliquot at 200 µl and freeze overnight at -20°C. 4. Store aliquots at -20 to -30°C.
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (w/o Ca2+ and Mg2+)			Dissolve pouch in 1 Liter of water to yield 1 liter of medium at 9.6 grams of powder per liter of medium. Store at 2-8 °C.
Forskolin stock solution (4.2 mg/ml; 1000X)			Add 1 ml of sterile DMSO to 50 mg Forskolin in bottle (Sigma-F6886) and pipette until resuspended. Transfer to a 15 ml centrifuge tube and add 11 ml of sterile DMSO to bring to 4.2 mg/ml. Aliquot (e.g. 20 µl) and store at -20°C.
Hank’s balanced salts (HBSS) (Sigma			1. Measure 900 ml of water (temperature 15-20 °C) in a cylinder and stir gently. 2. Add the power and stir until dissolved. 3. Rinse original package with a small amount of water to remove all traces of the powder. 4. Add to the solution in step 2. 5. Add 0.35 gr of sodium bicarbonate (7.5% w/v) for each liter of final volume. 6. Keep stirring until dissolved. 7. Adjust the pH of the buffer while stirring to 0.1-0.3 units below pH= 7.4 since it may rise during filtration. The use of 1N HCl or 1N NaOH is recommended to adjust the pH. 8. Add additional water to bring the final volume to 1L. 9. Sterilize by filtration using a membrane with a porosity of 0.22 microns. 10. Store at 2-8 °C.
Insulin stock solution (4000 µg/ml)			Thaw the bottle and aliquot 25 µl per microcentrifuge tube and store at -20°C.
Laminin solution			Slowly thaw laminin in the cold (2°C to 8°C) to avoid gel formation. Then, aliquot into polypropylene tubes. Store at 5° C to -20° C in aliquots (e.g. 20 µl) and do not freeze/thaw repeatedly. Laminin may be stored at these temperatures for up to six months.
Magnetic Cell Sorting (MCS) Buffer			Prepare the solution containing phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.2, and 0.5% bovine serum albumin (BSA), 0.5 mM EDTA, 5µg/ml Insulin, 1 g/L Glucose. Sterilize and degas by filtration the buffer by passing it through a 0.22 µm Millex filter. Store the buffer at 4°C until use
N-Acetyl-L-cysteine (NAC) stock solution (5mg/ml; 1000X)			Dissolve N-Acetyl-L-cysteine (Sigma-A8199) at 5 mg/ml in DMEM (e.g. 50 mg NAC in 10 ml B27NBMA). Filter sterilize and aliquot (e.g. 20 µl). Store at -20°C.
NT3 stock solution (1 µg/ml; 1000X)			Master stock: Order from Peprotech (450-03). Make up at 0.1 to 1 mg/ml according to manufacturer’s instructions (may vary from lot to lot), in buffer (e.g. DPBS + 0.2% BSA). Store at -80°C. Working stock (1µg/ml; 1000X): 1. Make on 0.2% BSA in DPBS solution and filter sterilize. 2. Dilute master stock aliquot to 1 µg/ml in sterile, chilled 0.2% BSA/DPBS. 3. Aliquot (e.g. 20µl/tube) and snap freeze in liquid nitrogen. 4. Store aliquots at -80°C.
PDGF stock solution (10 µg/ml; 1000X)			Master stock: Order from Peprotech (100-13A). Make up at 0.1 to 1 mg/ml according to manufacturer’s instructions (may vary from lot to lot) in buffer (e.g. DPBS) + 0.2% BSA). Store at -80°C. Working stock (1µg/ml; 1000X): 1. Make on 0.2% BSA in DPBS solution and filter sterilize. 2. Dilute master stock aliquot to 1µg/ml in sterile, chilled 0.2% BSA/DPBS. 3. Aliquot (e.g. 20µl/tube) and snap freeze in liquid nitrogen. 4. Store aliquots at -80°C.
Poly-D-lysine (1mg/ml; 100X)			Resuspend poly-D-lysine, molecular weight 70-150 kD (Sigma P6407) at 0.5mg/ml in 0.15M boric acid pH 8.4 (e.g. 50mg in 50ml borate buffer). Filter sterilize and aliquot (e.g. 100µl/tube). Store at -20°C. Prior to use, dilute the 100X stock (1mg/ml) to 50 µg/ml in sterile water.
Oligodendrocyte proliferation media			see Supplementary Table 1
Oligodendrocyte differentiation media			see Supplementary Table 1
Sato supplement (100X)			see Supplementary Table 1
References: the list of reagents and recipes were adopted from the protocols previously described by Emery et. al. 2013 (Emery, B. & Dugas, J. C. Purification of oligodendrocyte lineage cells from mouse cortices by immunopanning. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (9), 854-868, doi:10.1101/pdb.prot073973, (2013)) and Dincman et. al. (Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S. & Whittemore, S. R. Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells. J Neurosci Methods. 209 (1), 219-226, doi:10.1016/j.jneumeth.2012.06.017, (2012))

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Flores-Obando, R. E., Freidin, M. M., Abrams, C. K. Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes. J. Vis. Exp. (135), e57543, doi:10.3791/57543 (2018).