Vi beskriver den immunmagnetisk isolering av primära mus oligodendrocyter, som tillåter en snabb och specifik isolering av cellerna för in vitro- kultur.
Effektiva och robusta isolering och kultur av primära oligodendrocyter (OLs) är ett värdefullt verktyg för in vitro- studier av utvecklingen av oligodendroglia samt biologi demyeliniserande sjukdomar som multipel skleros och Pelizaeus-Merzbacher-liknande sjukdom (PMLD). Här presenterar vi en enkel och effektiv urvalsmetod för immunmagnetisk isolering av etapp tre O4+ preoligodendrocytes celler från neonatala möss pups. Eftersom omogna OL utgör mer än 80% av den gnagare-hjärn vita substansen postnatal dag 7 (P7) som denna isolering metod garanterar inte bara cellernas kickavkastning, men också specifika isolering av OLs redan åtagit sig att oligodendroglial härstamning, minskar den möjligheten att isolera kontaminerande såsom astrocyter och andra celler från mus hjärnan. Denna metod är en modifiering av de tekniker som tidigare rapporterats, och ger oligodendrocyte förberedelse renhet över 80% i ca 4 h.
Oligodendrocyter (OLs) är myelinating celler i det centrala nervsystem (CNS)1. Isolering och kultur av primära oligodendrocyter i en hårt reglerad miljö är ett värdefullt verktyg för in vitro- studier av utvecklingen av oligodendroglia samt biologi demyeliniserande sjukdomar såsom multipel skleros2 . Detta kräver en effektiv och robust oligodendrocyte isolering och kultur metod3. I denna studie tog vi fördel av uttrycket av en distinkt oligodendrocyte cell surface markör att genomföra en modifierad isolering teknik som är snabb och specifika.
Fyra olika faser av oligodendrocyte mognad har identifierats, var och en kännetecknas av uttrycket av särskiljande cell yta markörer för varje utvecklingsfas (figur 1). Dessa cell yta markörer kan kännas igen av specifika antikroppar4,5, och kan användas för att isolera OLs i specifika stadier. I den första etappen har oligodendrocyte föregångare celler (OPCs) förmåga att föröka sig, migrera och specifikt express trombocyt-härrör tillväxtfaktor receptor (PDGF-Rα)6, ganglioside A2B5, proteoglykan NG27,8 , polysialic syra-neurala cell adhesion molekyl9 och fettsyror-syra-bindande protein 7 (FABP7)10. OPCs har bipolär morfologi med några korta processer som härrör från de motsatta polerna av cell kroppen, vilket är karaktäristiskt för neurala föregångare celler11.
Figur 1: uttryck för cell yta markörer under musen oligodendrocyte utvecklingen. OLs cell yta markörer såsom A2B5, GalC (O1), NG2, O4 och PDGF-Rα kan användas för att isolera specifikt oligodendrocyter på särskilda utvecklingsstadier med hjälp av specifika antikroppar. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
I den andra etappen, OPCs ge upphov till preoligodendrocytes och express på cellmembranet inte bara OPC markörer, men också den sulfatide (en sulfaterade galactolipid) erkänns den O4 antikropp12,13och GPR17 protein14 som framhärdar till omogna oligodendrocyte (OL) scenen. I detta skede förlänga preoligodendrocytes multipolär kort processer. Preoligodendrocytes är den stora OL-scenen på postnatal dag 2 (P2) i den cerebrala vita substansen i både råtta och mus med en mindre befolkning av omogna OLs15.
Under den tredje etappen fortsätta omogna OLs att uttrycka O4, förlora uttryck för A2B5 och NG2 markörer och börjar uttrycka galactocerebroside C16. I detta skede OLs är engagerade av oligodendroglial härstamning och bli efter mitotiska celler med långa förgrenat grenar17,18. Omogna OL utgör mer än 80% av de gnagare vit substansen på P7 och vid denna tid de första MBP+ -cellerna observeras15,19,20,21. Isolering av OLs på P7 kunde därför säkerställa cellernas kickavkastning.
I det sista och fjärde utvecklingsstadiet OL express mogen OLs myelinating proteiner (myelin grundläggande protein (MBP), proteolipid protein (PLP), myelinet förknippas glykoprotein (MAG) och myelin oligodendrocyte glykoprotein (MOG)22,23 ,24,25,26. I detta skede mogen OLs förlänga membran att formuläret kompakt omsluter slidor runt axoner och kunna myelinate. Detta sammanfaller med observationen att i råtta och mus hjärna, MBP+ celler blir alltmer riklig P1419,20,21.
Sedan den första isoleringen av oligodendrocyte av Fewster och kollegor i 196727, har flera metoder för isolering av OLs från gnagare CNS genomförts inklusive immunopanning28,29,30, fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS) att utnyttja cell surface-specifika antigener28,31, differentiell gradient centrifugering32,33,34,35 och en skakning metod baserad på differentiell följsamhet av olika CNS glia36,37. Befintliga kultur metoder har dock begränsningar, särskilt när det gäller renhet, avkastning och tid som krävs för att utföra de förfarande38. Därför krävs effektivare isoleringsmetoder för oligodendrocyter.
I detta papper, vi presentera ett enkelt och effektivt urvalsmetod för immunmagnetisk isolering av etapp tre O4+ preoligodendrocytes celler från neonatala möss pups. Denna metod är en modifiering av de tekniker som rapporterats av Emery et al. 39 och Dincman o.a. 40 och ger en oligodendrocyte förberedelse renhet över 80% i ca 4 h.
I detta meddelande presenterar vi en metod för effektiv isolering av högrenade omogna mus oligodendrocyte kulturer. Denna metod jämfört med tidigare publicerade protokoll39,40, och gav en högre renhetsgrad med en lägre grad av Fredsgenomförande-positiv astrocyter och en mycket liten andel av andra icke-kännetecknas celler. Det är viktigt att påpeka att dessa är omogna OLs redan åtagit sig att oligodendroglial härstamning. Dessa celler skulle således…
The authors have nothing to disclose.
Denna studie stöddes av bidrag från den nationell multipelskleros samfund (RG4591A1/2) och National Institutes of Health (R03NS06740402). Författarna tackar Dr. Ivan Hernandez och hans lab-medlemmar för att ge laboratorium utrymme, utrustning och råd.
10ml serological pipets | Fisher Scientific | 13-676-10J | |
10ml syringe Luer-Loc tip | BD, Becton Dickinson | 309604 | |
15ml conical tubes | Falcon | 352097 | |
24-well tissue culture plates | Falcon | 353935 | |
40µm cell strainer | Fisher Scientific | 22368547 | |
50ml conical tubes | Falcon | 352098 | |
5ml serological pipets | Fisher Scientific | 13-676-10H | |
60mm tissue culture plates | Falcon | 353002 | |
70µm cell strainer | Fisher Scientific | 22363548 | |
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody | Invitrogen | A11001 | |
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgM (H+L) secondary antibody | Invitrogen | A21042 | |
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgM (H+L) secondary antibody | Invitrogen | A11008 | |
Alexa Fluor 594 goat anti-chicken IgG (H+L) secondary antibody | Invitrogen | A11042 | |
Anti-O4 beads- Anti-O4MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-094-543 | |
Apo-Transferrin human | Sigma | T1147 | |
Autofil complete bottle top filter assembly, 0.22um filter, 250ml | USA Scientific | 6032-1101 | |
Autofil complete bottle top filter assembly, 0.22um filter, 250ml | USA Scientific | 6032-1102 | |
B27 Supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
Boric acid | Sigma | B7660 | |
Bovine Growth Serum (BGS) | GE Healthcare Life Sciences | SH30541.03 | |
BSA | Fisher Scientific | BP-1600-100 | |
CNTF | Peprotech | 450-50 | |
d-Biotin | Sigma | B4639 | |
Desoxyribonuclease I (DNAse I) | Worthington | LS002007 | |
EDTA | Fisher Scientific | S311 | |
Epifluorescence microscope with an Olympus DP70 camera | Olympus | Bx51 | |
Feather disposable scalpels | Andwin Scientific | EF7281C | |
Forskolin | Sigma | F6886 | |
German glass coverslips, #1 thickness, 12mm diameter round | NeuVitro | GG-12-oz | |
GFAP antibody | Aves | GFAP | |
Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
GlutaMAX | Invitrogen | 35050-61 | |
Insulin | Invitrogen | 12585-014 | |
Magnetic separator stand – MACS multistand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
Magnetic separator-MiniMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
Millex PES 0.22µm filter unit | Millipore | SLG033RS | |
Mounting media- Prolong Gold with DAPI | Thermo Fisher | P36930 | |
N-acetyl-cysteine (NAC) | Sigma | A8199 | |
Natural mouse laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
Neurobasal Medium A | Invitrogen | 10888-022 | |
Neurotrophin-3 (NT-3) | Peprotech | 450-03 | |
NG2 antibody | Millipore | AB5320 | |
Papain | Worthington | LS003126 | |
PBS without Ca2+ and Mg2+ | Sigma | D5652 | |
PDGF | Peprotech | 100-13A | |
Petri dishes | Falcon | 351029 | |
Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
Primocin | Invivogen | ant-pm-2 | |
Progesterone | Sigma | P8783 | |
Putrescine | Sigma | P5780 | |
Selection column-LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
Sodium Selenite | Sigma | S5261 | |
Trace elements B | Corning | 25-000-CI | |
Triiodothyronine (T3) | Sigma | T6397 | |
Triton-X | Sigma | T8787 | |
Trypan Blue Solution | Corning | 25-900-CI | |
Tween 20 | Sigma | P1379 | |
B27NBMA | 487.75 mL Neurobasal Medium A; 10 mL B27 Supplement; 1 mL Primocin; 1.25 mL Glutamax; Filter sterilize and store at 4 °C until use. | ||
B27NBMA + 10% BGS | 27 mL B27NBMA; 3 mL Bovine growth serum | ||
CNTF solution stock (10 µg/ml; 1000X) | Order from Peprotech (450-50). Make up at 0.1 to 1 mg/ml according to Manufacturer’s instruction (may vary from lot to lot) in buffer (e.g. DPBS + 0.2% BSA). Store at -80 °C. Working solution (10 µg/ml, 1000X) 1. Make on 0.2% BSA (Fisher scientific BP-1600-100) in DPBS solution and filter sterilize. 2. Dilute master stock aliquot to 10µg/ml in sterile, chilled 0.2% BSA/DPBS. 3. Aliquot (20µl/tube) and snap freeze in liquid nitrogen. 4. Store aliquots at -80 °C. |
||
d-Biotin stock solution (50 µg/ml; 5000X) | Resuspend d-Biotin (Sigma-B4639) in double-distilled H2O at 50 µg/ml (e.g. 2.5 mg in 50 ml of ddH2O). Resuspension might take fair amount of agitation/vortexing, or mild warming briefly at 37°C. If the d-Biotin still will not solubilize, it is fine to make up a less concentrated (e.g. 10µg/ml), and to add a higher volume to the B27NBMA (1/1000), instead of 1/5000). Store at 4°C. | ||
DNase I stock solution | 1. Dissolve at 12,500 U Deoxyribonuclease I / ml in HBSS chilled on ice. 2. Filter sterilize on ice 3. Aliquot at 200 µl and freeze overnight at -20°C. 4. Store aliquots at -20 to -30°C. |
||
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (w/o Ca2+ and Mg2+) | Dissolve pouch in 1 Liter of water to yield 1 liter of medium at 9.6 grams of powder per liter of medium. Store at 2-8 °C. | ||
Forskolin stock solution (4.2 mg/ml; 1000X) | Add 1 ml of sterile DMSO to 50 mg Forskolin in bottle (Sigma-F6886) and pipette until resuspended. Transfer to a 15 ml centrifuge tube and add 11 ml of sterile DMSO to bring to 4.2 mg/ml. Aliquot (e.g. 20 µl) and store at -20°C. | ||
Hank’s balanced salts (HBSS) (Sigma | 1. Measure 900 ml of water (temperature 15-20 °C) in a cylinder and stir gently. 2. Add the power and stir until dissolved. 3. Rinse original package with a small amount of water to remove all traces of the powder. 4. Add to the solution in step 2. 5. Add 0.35 gr of sodium bicarbonate (7.5% w/v) for each liter of final volume. 6. Keep stirring until dissolved. 7. Adjust the pH of the buffer while stirring to 0.1-0.3 units below pH= 7.4 since it may rise during filtration. The use of 1N HCl or 1N NaOH is recommended to adjust the pH. 8. Add additional water to bring the final volume to 1L. 9. Sterilize by filtration using a membrane with a porosity of 0.22 microns. 10. Store at 2-8 °C. |
||
Insulin stock solution (4000 µg/ml) | Thaw the bottle and aliquot 25 µl per microcentrifuge tube and store at -20°C. | ||
Laminin solution | Slowly thaw laminin in the cold (2°C to 8°C) to avoid gel formation. Then, aliquot into polypropylene tubes. Store at 5° C to -20° C in aliquots (e.g. 20 µl) and do not freeze/thaw repeatedly. Laminin may be stored at these temperatures for up to six months. | ||
Magnetic Cell Sorting (MCS) Buffer | Prepare the solution containing phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.2, and 0.5% bovine serum albumin (BSA), 0.5 mM EDTA, 5µg/ml Insulin, 1 g/L Glucose. Sterilize and degas by filtration the buffer by passing it through a 0.22 µm Millex filter. Store the buffer at 4°C until use | ||
N-Acetyl-L-cysteine (NAC) stock solution (5mg/ml; 1000X) | Dissolve N-Acetyl-L-cysteine (Sigma-A8199) at 5 mg/ml in DMEM (e.g. 50 mg NAC in 10 ml B27NBMA). Filter sterilize and aliquot (e.g. 20 µl). Store at -20°C. | ||
NT3 stock solution (1 µg/ml; 1000X) | Master stock: Order from Peprotech (450-03). Make up at 0.1 to 1 mg/ml according to manufacturer’s instructions (may vary from lot to lot), in buffer (e.g. DPBS + 0.2% BSA). Store at -80°C. Working stock (1µg/ml; 1000X): 1. Make on 0.2% BSA in DPBS solution and filter sterilize. 2. Dilute master stock aliquot to 1 µg/ml in sterile, chilled 0.2% BSA/DPBS. 3. Aliquot (e.g. 20µl/tube) and snap freeze in liquid nitrogen. 4. Store aliquots at -80°C. |
||
PDGF stock solution (10 µg/ml; 1000X) | Master stock: Order from Peprotech (100-13A). Make up at 0.1 to 1 mg/ml according to manufacturer’s instructions (may vary from lot to lot) in buffer (e.g. DPBS) + 0.2% BSA). Store at -80°C. Working stock (1µg/ml; 1000X): 1. Make on 0.2% BSA in DPBS solution and filter sterilize. 2. Dilute master stock aliquot to 1µg/ml in sterile, chilled 0.2% BSA/DPBS. 3. Aliquot (e.g. 20µl/tube) and snap freeze in liquid nitrogen. 4. Store aliquots at -80°C. |
||
Poly-D-lysine (1mg/ml; 100X) | Resuspend poly-D-lysine, molecular weight 70-150 kD (Sigma P6407) at 0.5mg/ml in 0.15M boric acid pH 8.4 (e.g. 50mg in 50ml borate buffer). Filter sterilize and aliquot (e.g. 100µl/tube). Store at -20°C. Prior to use, dilute the 100X stock (1mg/ml) to 50 µg/ml in sterile water. | ||
Oligodendrocyte proliferation media | see Supplementary Table 1 | ||
Oligodendrocyte differentiation media | see Supplementary Table 1 | ||
Sato supplement (100X) | see Supplementary Table 1 | ||
References: the list of reagents and recipes were adopted from the protocols previously described by Emery et. al. 2013 (Emery, B. & Dugas, J. C. Purification of oligodendrocyte lineage cells from mouse cortices by immunopanning. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (9), 854-868, doi:10.1101/pdb.prot073973, (2013)) and Dincman et. al. (Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S. & Whittemore, S. R. Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells. J Neurosci Methods. 209 (1), 219-226, doi:10.1016/j.jneumeth.2012.06.017, (2012)) |