Transkripsiyon faktörü Olig2 genomik bağlayıcı siteleri içinde akut tanımlayan PDGFRα + hücreleri tarafından analiz sıralama düşük hücreli Kromatin Immunoprecipitation saf
Summary
Burada genom çapında bağlamasında oligodendrocyte transkripsiyon faktörü 2 (Olig2) Akut arıtılmış beyin oligodendrocyte öncü hücreleri (OPCs) düşük-hücre Kromatin immunoprecipitation (ChIP) gerçekleştirerek analiz etmek için tasarlanmış bir protokol mevcut , Kütüphane hazırlık, yüksek işlem hacmi sıralama ve bioinformatic veri analizi.
Abstract
Memeli hücrelerinde gen transkripsiyonu genomik DNA transkripsiyon faktörlerin etkileşim tarafından bir hücre türü belirli şekilde düzenlenir. Lineage özgü transkripsiyon faktörleri hücre özellikleri ve farklılaşma geliştirme sırasında önemli rollerde oynamak için kabul edilir. Küçük parça ile yüksek-den geçerek DNA sıralama (ChIP-seq) birleştiğinde transkripsiyon faktörleri (veya onun ilişkili kompleks) genom çapında bağlayıcı siteleri için genomik DNA analiz için yaygın olarak kullanılır. Ancak, çok sayıda hücreleri izole Primer hücre veya nadir hücre popülasyonlarının sınırlı sayıda çalışmaya zorlaştırır bir standart çip tepki için gereklidir. Oligodendrocyte soy özgü transkripsiyon düzenleyici mekanizma anlamak için faktör akut arıtılmış fare OPCs, Olig2 (veya Olig2 karmaşık) genom çapında bağlayıcı siteleri tanımlamak için ChIP-seq kullanarak ayrıntılı bir yöntem Olig2 gösterilir. İlk olarak, protokol trombosit-türevi büyüme faktörü reseptör alfa (PDGFRα) arındırmak açıklar fare beyni gelen olumlu OPCs. Daha sonra ChIP Olig2 antikor aracılı ve Kütüphane inşaat yapılmaktadır. Son kısmı bioinformatic yazılım ve Olig2 ChIP-seq çözümlemesi için kullanılan yordamları açıklar. Özet olarak, bu kağıt transkripsiyon faktörü Olig2 akut arıtılmış beyin OPCs genom geniş bağlantıları analiz etmek için bir yöntem bildirir.
Introduction
Protein (ya da protein kompleksi) eğitim önemlidir DNA bağlama ve epigenetik işaretleri transkripsiyon düzenleyici ağlar çeşitli biyolojik süreçlerinde yer alan oluşturmak için. Özellikle, genomik DNA transkripsiyon faktörleri bağlamaları gen düzenlemesi, hücre farklılaşma ve doku gelişiminde önemli bir rol oynayabilir. Transkripsiyon yönetmelik ve epigenetik mekanizmalar çalışmak için güçlü bir araç Kromatin immunoprecipitation (ChIP) olduğunu. Yeni nesil sıralama teknolojisi hızlı gelişmeler sayesinde, küçük parça ile yüksek-den geçerek DNA sıralama (ChIP-seq) birleştiğinde protein-DNA bağlama ve epigenetik işaretleri1analizleri için kullanılır. Ancak, standart bir çip seq protokol cep numarası, izole Primer hücre ve nadir hücre popülasyonlarının gibi sınırlı olduğunda bu tekniğin uygulanması zor yapar reaksiyon, başına yaklaşık 20 milyon hücre gerektirir.
Oligodendrocyte soy hücreleri oligodendrocyte öncü hücreleri (OPCs) ve oligodendrocytes de dahil olmak üzere yaygın beyin dağıtılır ve geliştirme ve beyin fonksiyonu için gereklidir. Öncül hücreleri bir türü olarak OPCs kendini yenileme ve farklılaşma yeteneğine sahiptirler. OPCs sadece oligodendrocytes için ataları olarak hizmet ama nöronal beyin hücreleri2diğer türleri ile iletişim kurarak sinyal yayma de önemli bir rol oynamaktadır. Önceki çalışmalarda oligodendrocyte geliştirme Olig2 ve Sox103,4gibi soy özgü transkripsiyon faktörleri tarafından düzenlenmiştir düşündürmektedir. Bu transkripsiyon faktörleri oligodendrocyte özellikleri ve farklılaşma sırasında onların ifade etkilemek için çok önemli bazı genler organizatörü veya artırıcı bölgelerinde bağlamak için bulunamadı. Ancak, DNA bağlayıcı protein (veya protein kompleksi) Akut arıtılmış birincil OPCs çok sınırlı sayıda hücre ile ilgi tanımlamak için meydan okuyor.
Bu iletişim kuralı, sistematik olarak saflaştırılmış fare OPCs ChIP-seq tekniği kullanarak genom geniş ölçekte Olig2 tarafından genomik DNA immunoprecipitated araştırmak açıklar. OPCs fare beyni gelen akut immunopanning tarafından saflaştırılmış ve nükleer silahların yayılmasına karşı içinde vitroolmadan bir çip deneyinde kullanılan. OPCs sınırlı sayıda immunopanning tarafından elde edilebilir ve standart ChIP-seq deneyler için yeterli değil. Burada, bir düşük hücreli yonga-seq iletişim kuralı ile düşük çip tepki transkripsiyon faktörleri için başına 20 bin hücre olarak tanımlanır. Kısacası, çapraz bağlı hücreler lysed ve Kromatin yamultmak için sonication aygıt tarafından sonicated. Yamultulmuş Kromatin Olig2 antikor yanı sıra protein A kaplı boncuk Olig2 bağlı antikor genomik DNA çökelti inkübe. Protein A kaplı boncuk ve ters cross-linking elüsyon sonra genomik DNA Olig2 antikor tarafından çöktürülmüş fenol kloroform çıkarma tarafından saflaştırıldı. Çarpım sayılabilir ve T-takip için tabi, astar şablon anahtarlama ve uzantısı, ayrıca bağdaştırıcıları ve güçlendirme, Kütüphane boyutu seçimi ve arıtma tavlama ChIP-seq Kütüphane inşaat için adımlar.
Sonra sıralama, Olig2 transkripsiyon faktörü antikor ile hazırlanan örnek ve denetimi örneğini ham okuma kalitesini analiz edildi. Düşük kaliteli baz çifti ve bağdaştırıcısı içeren parçaları kesilmiş okuyun. Sonraki, kesilmiş okuma fare başvuru genom için uyumlu. Çip okuma denetimi örneğini için karşılaştırıldığında, tepeler algılanan için önemli ölçüde zenginleştirilmiş genomik bölgeleri. Potansiyel transkripsiyon faktörü bağlayıcı siteleri, temsil eden önemli dorukları filtre ve genom tarayıcıda görüntülenir.
Özellikle, bu protokol için açıklanan yöntemi ChIP-seq sınırlı sayıda herhangi bir hücre türü ile diğer transkripsiyon faktörlerin genel olarak kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Memeli gen düzenleme ağları çok karmaşıktır. Çip seq genom çapında protein-DNA etkileşimleri araştırmak için güçlü bir yöntemdir. Bu protokolü nasıl fare beyni (gibi düşük tepki başına 20 bin hücre) saf OPCs düşük bir dizi kullanarak Olig2 ChIP-seq gerçekleştirileceği içerir. Bu iletişim kuralı için önemli bir ilk adım OPCs fare beyni PDGFRα antikor ile immunopanning tarafından gelen arıtma olduğunu. OPCs kaplı PDGFRα plakalı pozitif seçim için PDGFRα OPCs kez zayıf bağla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JQW, XD, RCDD ve YY sağlık R01 NS088353 Ulusal kurumları gelen hibe tarafından desteklenen edildi; NIH grant 1R21AR071583-01; Staman Ogilvie Fonu-Memorial Hermann Vakfı; UTHealth beyin girişimi ve CTSA UL1 TR000371; ve University of Texas sistem Nörobilim ve NÖROTEKNOLOJİ Araştırma Enstitüsü (Grant #362469) bir hibe.
Materials
| Reagent/ Equipment | |||
| Banderiaea simplicifolia lectin 1 | Vector Laboratories | # L-1100 | |
| Rat anti-PDGFRa antibody | BD Bioscience | # 558774 | |
| Neural tissue dissociation Kit (P) | MACS Miltenyi Biotec | # 130-092-628 | |
| Accutase | STEMCELL technologies | # 07920 | |
| TRIzol | Thermo Fisher | # 15596026 | |
| Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan Antibody | Millipore | # AB5320 | |
| Bioruptor Pico sonication device | Diagenode | # B01060001 | |
| True MicroChIP kit | Diagenode | # C01010130 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) | Thermo Fisher | # 15593031 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up kit | MACHEREY-NAGEL | # 740609 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher | # P11496 | |
| DNA SMART ChIP-Seq kit | Clontech Laboratories | # 634865 | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Voulter | # A63880 | |
| GlycoBlue | Thermo Fisher | # AM9516 | |
| pico-green | Thermo Fisher | # P11496 | |
| D-PBS | Thermo Fisher | # 14190-144 | |
| SYBR Green master mix | Bio-Rad Laboratories | # 1725124 | |
| DMEM/F12 | Fisher Scientific | # 11-320-033 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | Fisher Scientific | # 15140122 | |
| N-2 Supplement | Fisher Scientific | # 17502048 | |
| B-27 Supplement | Fisher Scientific | # 17504044 | |
| insulin | Sigma | # I6634 | Prepare 0.5 mg/ml insulin solution by dissolving 5 mg insulin in 10 ml water and 50 μl of 1 N HCl. |
| Bovine Serum Albumin, suitable for cell culture (BSA) | Sigma | # A4161 | Prepare 4% BSA solution by dissolving 4 g BSA in 100 ml D-PBS and adjust the pH to 7.4 |
| Fibroblast Growth Factor basic Protein, Human recombinant (bFGF) | EMD Millipore | # GF003 | |
| HUMAN PDGF-AA | VWR | # 102061-188 | |
| poly-D-lysine | VWR | # IC15017510 | Prepare 1 mg/ml poly-D-lysine solution by dissolving 10 mg poly-D-lysine in 10 ml water and dilute 100 times when using. |
| Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning, 100x15mm | VWR | # 25373-100 | |
| Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning, 150x15mm | VWR | # 25373-187 | |
| HBSS, 10X, no Calcium, no Magnesium, no Phenol Red | Fisher Scientific | # 14185-052 | |
| Trypan Blue | Stemcell Technologies | # 07050 | |
| protease inhibitor cocktail | Sigma | # 11697498001 | |
| Software | |||
| FastQC | [10] http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ | Obtaining quality control metrics of raw and trimmed reads | |
| Trimmomatic 0.33 | [11] http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic | Trimming and filtering raw reads | |
| GENCODE mm10 | ftp://ftp.sanger.ac.uk/pub/gencode/Gencode_mouse/release_M15/GRCm38.primary_assembly.genome.fa.gz | Mouse reference genome | |
| Bowtie2 2.2.4 | [12] http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml | Aligning reads to a reference genome | |
| SAMTools 1.5 | [13] http://samtools.sourceforge.net/ | Converting SAM file into BAM format | |
| HOMER 4.9.1 | [14] http://homer.ucsd.edu/homer/ | Creating a tag directory and annotating enriched genomic regions with gene symbols | |
| R 3.2.2 | [15] https://www.R-project.org/ | Programming scripts and running functions | |
| SPP 1.13 | [16] https://github.com/hms-dbmi/spp | Creating a strand cross-correlation plot | |
| MACS2 2.2.4 | [17] https://github.com/taoliu/MACS | Finding regions of ChIP enrichment over control | |
| BEDTools 2.25 | [18] http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/ | Genome arithmetics | |
| bedGraphToBigWig | http://hgdownload.cse.ucsc.edu/admin/exe/ | Converting bedGraph file into bigwig | |
| IGV browser 2.3.58 | [19] http://software.broadinstitute.org/software/igv/ | Visualization and browsing of significant ChIP-seq peaks | |
| Microsoft Excel | Spreasheet program | ||
| ENCODE's blacklist | https://sites.google.com/site/anshulkundaje/projects/blacklists | Filtering peaks | |
| mm10.chrom.sizes | http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/mm10/bigZips/mm10.chrom.sizes. | Converting bedGraph file into bigwig | |
| ENCODE's motif database | [25] http://compbio.mit.edu/encode-motifs/ | Comprehensive motif database required for motif enrichment | |
| MEME-ChIP | [20] http://meme-suite.org/index.html | Motif enrichment analysis and motif discovery | |
| Primer names used for qPCR | Primer sequences used for qPCR | ||
| Mbp-F: | CTATAAATCGGCTCACAAGG | ||
| Mbp-R: | AGGCGGTTATATTAAGAAGC | ||
| Iba1-F: | ACTGCCAGCCTAAGACAACC | ||
| Iba1-R: | GCTTTTCCTCCCTGCAAATCC | ||
| Mog-F: | GGCTTCTTGGAGGAAGGGAC | ||
| Mog-R: | TGAATTGTCCTGCATAGCTGC | ||
| GAPDH-F | ATGACATCAAGAAGGTGGTG | ||
| GAPDH-R | CATACCAGGAAATGAGCTTG | ||
| Tuj1-F | TTTTCGTCTCTAGCCGCGTG | ||
| Tuj1-R | GATGACCTCCCAGAACTTGGC | ||
| PDGFRα-F | AGAGTTACACGTTTGAGCTGTC | ||
| PDGFRα-R | GTCCCTCCACGGTACTCCT |
References
- Wu, J. Q., et al. Tcf7 is an important regulator of the switch of self-renewal and differentiation in a multipotential hematopoietic cell line. PLoS Genet. 8 (3), e1002565 (2012).
- Zuchero, J. B., Barres, B. A. Intrinsic and extrinsic control of oligodendrocyte development. Curr Opin Neurobiol. 23 (6), 914-920 (2013).
- Liu, Z., et al. Induction of oligodendrocyte differentiation by Olig2 and Sox10: evidence for reciprocal interactions and dosage-dependent mechanisms. Dev Biol. 302 (2), 683-693 (2007).
- Dong, X., et al. Comprehensive Identification of Long Non-coding RNAs in Purified Cell Types from the Brain Reveals Functional LncRNA in OPC Fate Determination. PLoS Genet. 11 (12), e1005669 (2015).
- Hilgenberg, L. G., Smith, M. A. Preparation of dissociated mouse cortical neuron cultures. J Vis Exp. (10), e562 (2007).
- Emery, B., Dugas, J. C. Purification of oligodendrocyte lineage cells from mouse cortices by immunopanning. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (9), 854-868 (2013).
- Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J Neurosci. 28 (1), 264-278 (2008).
- Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. J Neurosci. 34 (36), 11929-11947 (2014).
- Cheng, X., et al. Bone morphogenetic protein signaling and olig1/2 interact to regulate the differentiation and maturation of adult oligodendrocyte precursor cells. Stem Cells. 25 (12), 3204-3214 (2007).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Mol Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
- Team, R. C. A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , (2015).
- Kharchenko, P. V., Tolstorukov, M. Y., Park, P. J. Design and analysis of ChIP-seq experiments for DNA-binding proteins. Nat Biotechnol. 26 (12), 1351-1359 (2008).
- Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nat Biotechnol. 29 (1), 24-26 (2011).
- Bailey, T. L., et al. MEME SUITE: tools for motif discovery and searching. Nucleic Acids Res. 37 (Web Server issue), W202-W208 (2009).
- Sims, D., Sudbery, I., Ilott, N. E., Heger, A., Ponting, C. P. Sequencing depth and coverage: key considerations in genomic analyses. Nat Rev Genet. 15 (2), 121-132 (2014).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).
- Consortium, E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Mazzoni, E. O., et al. Embryonic stem cell-based mapping of developmental transcriptional programs. Nat Methods. 8 (12), 1056-1058 (2011).
- Kheradpour, P., Kellis, M. Systematic discovery and characterization of regulatory motifs in ENCODE TF binding experiments. Nucleic Acids Res. 42 (5), 2976-2987 (2014).
- Dugas, J. C., Tai, Y. C., Speed, T. P., Ngai, J., Barres, B. A. Functional genomic analysis of oligodendrocyte differentiation. J Neurosci. 26 (43), 10967-10983 (2006).
- Gilfillan, G. D., et al. Limitations and possibilities of low cell number ChIP-seq. BMC Genomics. 13, 645 (2012).
- Raskatov, J. A., et al. Modulation of NF-kappaB-dependent gene transcription using programmable DNA minor groove binders. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1023-1028 (2012).
- Cheneby, J., Gheorghe, M., Artufel, M., Mathelier, A., Ballester, B. ReMap 2018: an updated atlas of regulatory regions from an integrative analysis of DNA-binding ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res. , (2017).
- Yevshin, I., Sharipov, R., Valeev, T., Kel, A., Kolpakov, F. GTRD: a database of transcription factor binding sites identified by ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res. 45 (D1), D61-D67 (2017).
- Kulakovskiy, I. V., et al. HOCOMOCO: a comprehensive collection of human transcription factor binding sites models. Nucleic Acids Res. 41 (Database issue), D195-D202 (2013).
- Jain, D., Baldi, S., Zabel, A., Straub, T., Becker, P. B. Active promoters give rise to false positive ‘Phantom Peaks’ in ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res. 43 (14), 6959-6968 (2015).
- Gerstein, M. B., et al. Architecture of the human regulatory network derived from ENCODE data. Nature. 489 (7414), 91-100 (2012).
