Protokollen presenterer Escherichia coli-basert seleksjonspress innlemmelse av ikke-kanoniske aminosyrer (ncAAs) i lactococcal antimikrobielle peptid nisin. Egenskaper kan endres under rekombinant uttrykk via substitusjon med ønsket ncAAs i definerte vekst medier. Resulterende endringer i bioactivity tilordnes av vekst hemming analyser og fluorescens mikroskopi.
Naturen har en rekke muligheter til å opprette nye protein funksjoner ved å endre rekkefølgen på individuelle aminosyre byggesteinene. Men er alle varianter basert på 20 kanoniske aminosyrer (cAAs). Som en måte å innføre flere mekanisk-egenskaper i polypeptides, brukes stadig inkorporering av ikke-kanoniske aminosyrer (ncAAs) i protein engineering. På grunn av deres relativt kort lengden er endring av ribosomally syntetisert og post-translationally endret peptider ved ncAAs spesielt attraktivt. Nye funksjoner og kjemiske håndtak kan genereres ved endringer av personlige rester. Metoden seleksjonspress inkorporering (SPI) benytter auxotrophic vert stammer som er fratatt en essensiell aminosyre i kjemisk definerte vekst medier. Flere strukturelt og kjemisk ligner aminosyre analogs kan deretter aktiveres av det tilsvarende aminoacyl-tRNA-synthetase og gi rester-spesifikke cAA(s) → ncAA(s) erstatninger i målet peptid eller protein sekvensen. Selv om, i forbindelse med metoden SPI, ncAAs er også innlemmet i det vert proteom i fasen av rekombinant genuttrykk, er flertallet av cellens ressursene tildelt uttrykk for målet genet. Dette kan effektiv rester-spesifikke innlemmelse av ncAAs ofte ledsaget av store mengder endret mål. Presentert arbeidet beskriver i vivo kommisjonsforordning av seks proline analogs antimikrobielle peptid nisin, en lantibiotic naturlig produsert av Lactococcus lactis. Antimikrobielle egenskapene til nisin kan endres og utvidet under sin gjæring og uttrykk i auxotrophic Escherichia coli stammer i definerte vekst medier. Dermed levere effekten av rester-spesifikke utskifting av cAAs med ncAAs endringer i antimikrobielle aktivitet og spesifisitet. Antimikrobiell aktivitet analyser og fluorescens mikroskopi brukes til å teste de nye nisin variantene for vekst hemming Gram-positive Lactococcus lactis indikator belastning. Masse spectroscopy brukes til å bekrefte ncAA innlemmelse i bioaktive nisin varianter.
Oppdagelsen av antibiotika i det tyvende århundre og parallell utvikling av nye antimikrobielle forbindelser mot sykdomsfremkallende mikroorganismer aktivert målrettet behandling av bakterielle infeksjoner. Men på grunn av fremveksten av multidrug-resistente patogener som meticillinresistente Staphylococcusaureus (MRSA), vancomycin-resistente enterokokker (VRE), MDR (multidrug-resistente) Salmonella typhimurium phage type 10 (DT10 ), og Klebsiella pneumoniae, det er presserende nødvendig å generere nye antimikrobielle midler1. Antimikrobielle peptider (ampere) er allsidig, ofte svært spesifikke forbindelser som er lovende kandidater for utvikling av nye medisiner takket være deres mekanisk-egenskaper, fleksibilitet, størrelse, hydrophobicity og modus handling2. Forsterkere er små peptider som vanligvis består av 7-100 aminosyrer. Ofte, har de en kationisk struktur rik på positivt ladede arginin og lysin rester, som samhandle med målrettet mikrobiell cellemembranen, som belastes oppositely3. En bestemt undergruppe av forsterkere er ribosomally syntetisert og posttranslationally endret peptider (RiPPs)4. Disse er produsert av mange organismer fra kongedømmet sopp og domenet til bakterier. En av de mest kjente og brukte RiPPs er nisin, naturlig produsert av melkesyre bakterien Lactococcus lactis (L. lactis). Aktiv mot et panel av Gram-positive bakteriene, nisin har blitt brukt som en biopreservative i næringsmiddelindustrien for mer enn 50 år egenskapene antimikrobielle og fravær av utviklet motstand i målrettede mikrobiell stammer5. Studier har vist at nisin destabilizes og genererer porene i bakteriell cellemembraner fører til antimikrobielle aktivitet mot både Gram-positive og Gram-negative patogener6. Ved binding til lipid II er bakteriell cellevegg syntese hemmet7. Nisin er kodet av nisA som lineær forløper peptid, som består av en leder og en kjerne peptid region (figur 1). Etter ribosomal syntese endres først prenisin av dehydratase NisB. Her er serine og threonin rester i regionen prepeptide kjernen dehydrert dehydroalanine (Dha) og dehydrobutyrine (Dhb)8. Deretter dehydrert rester er kombinert med cystein til skjemaet lanthionine ringer (derav navnet “lantibiotic” for lanthionine ring inneholder antibiotika) av et enzym-katalysert Michael tillegg. Denne posttranslational endringen (PTM) er katalysert av cyclase NisC. Den endrede prenisin transporteres deretter ut av cellen av transporter NisT L. lactis, og leder peptid er kløyvde av proteinasen NisP å løslate moden og aktive nisin form9. Ansvarlig leder peptidase NisP har en høy substrat spesifisitet, siden det bare prosesser endret nisin effektivt10.
Vanligvis resultatet aktive RiPPs av PTM enzymer (for eksempel NisBC), som drastisk øker kjemiske løpet av kort peptider, f.eks via acetylation, glykosylering, metylering eller fosforylering. Dette nivået av kompleksitet kan videre bli utvidet med direkte inkorporering av ncAAs. Mens ofte mulig, er syntese av forsterkere en utfordring for storskala produksjon på grunn av strukturelle kompleksitet. For eksempel ble den totale syntesen av lantibiotic lactosin S i 71 reaksjon meter oppnådd med en siste avkastning på 10% og at av nisin med en grov avkastning bare 0.003%11,12. Derfor gir biologiske produksjon et levedyktig alternativ, på grunn av generasjonen av riktig stereocenters og høy produktkvalitet konsentrasjon.
Fram til i dag, mer enn 150 ncAAs, f.eks har funksjonelle grupper som inneholder fluor eller azides, har blitt innlemmet i rekombinante proteiner, og flere eksempler på ncAA-endret forsterkere har vært rapportert13,14, 15,16. Med innføringen av ncAAs, kan romanen mekanisk-egenskaper genereres sammenlignet med konvensjonelle mutagenese. Mangfoldet av eksisterende peptider kan økes, muligens fører til romanen antibiotika.
En metode for inkorporering av ncAAs rekombinant peptider er seleksjonspress inkorporering (SPI) basert på bruk av auxotrophic bakteriell stammer17. Disse stammer kan ikke syntetisere den tilsvarende cAA analoge i ncAA. Metodikken bruker ofte observert avslappet substrat spesifisitet, en funksjon i mange naturlige aminoacyl-tRNA synthetases (aaRSs)18. Bortsett fra deres naturlige cAA underlag er disse enzymene ofte i stand til å gjenkjenne og aktivere ønsket ncAA og lade den på deres beslektet tRNA(s). Dette fører til ribosomal innlemmelse av ncAA i målet gene produktet på en rest-spesifikk måte (dvs. cAA → ncAA substitusjon). Dette er selvfølgelig bare mulig når ønsket ncAA er strukturelt og kjemisk lik den kanoniske aminosyren tolerert av cellen fysiologi, oversettelse maskiner og målet peptid eller protein sekvensen. I en bestemt eksperimentelle oppsett, er auxotrophic verten cellene kultivert i definerte medium leveres med en begrensende konsentrasjon av den opprinnelige aminosyren skal erstattes. Av mobilnettet vekst eller utveksling av cAA-fri medium fører til intracellulær uttømming av cAA. I neste trinn ncAA legges og genuttrykk målet er indusert. Uunngåelig, ncAAs er nå også innlemmet i mange andre proteiner i vert cellen i denne fasen av målet genuttrykk. Likevel toksisitet av SPI holdes på et lavt nivå siden Escherichia coli (E. coli) belastningen er forvandlet en plasmider bærer målet genet under kontroll av en sterk pådriver (vanligvis svært konkurransedyktige T7 promoter / RNA polymerase system)19. Umiddelbart etter induksjon (vanligvis når Luftfartstilsynet er oppbrukt), verten cellene slutte å vokse og deres cytoplasma enzymatisk machineries brukes hovedsakelig for uttrykket av plasmider-baserte målet genet. Nettstedet-rettet mutagenese kan brukes til å definere steder rester-spesifikke ncAA installasjon i målet genet20.
Som modell peptid inkorporering av ncAAs, ble pentacyclic AMP nisin A valgt. Det er 34 aminosyrer lang og har bare en enkelt proline rester i kjernen peptid sekvensen (figur 1). Som subtilisin, ericin A og S og epidermin samt nisin Z og nisin Q synes den bevart proline å være avgjørende for aktivitet9,21. CAA proline spiller en særdeles viktig rolle i peptidyl-prolyl amid rotasjon og sekundær stabilisering. Siden kjeden ring konformasjonen (exo / endo puckers) er ansvarlig for en termodynamisk stabilisering av amid bånd. Målrettet kjemiske modifikasjoner (for eksempel hydroxylations, fluorinations, methylations) av prolyl puckers påvirker ofte kritisk folding stabilitet, stillaset stivhet og funksjoner av mange biologiske strukturer22. Det er derfor sannsynlig å forvente at Pro→ proline analoge erstatninger vil gi gave til ringen B, den andre ringen av nisin, med romanen og uvanlige egenskaper.
Her, en proline-auxotrophic E. coli belastningen ble brukt for rekombinant nisin produksjon. Dette krever uttrykket av prepeptide genet nisA samt endring enzym gener nisBC. Genetisk kodet peptid produktet bærer en N-terminalt hans-merket leder for rensing via affinitet kromatografi. For aktivitet besluttsomhet brukes L. lactis uttrykke og sekresjon NisPT til å aktivere varianter av rekombinant nisin fra E. coli celle lysates eller renset peptid prøver (figur 1). Eldre AMP er utgitt etter spalting av leder av NisP. I denne agar diffusjon metoden, AMP prøven diffunderer til solid vekst medium og kan hemme veksten av de Gram-positive mikroorganismen. Etter inkubasjon kan dette observeres visuelt av vekst hemming glorier. I tillegg til L. lactis som en indikator, endret nisin varianter viste antimikrobielle aktivitet mot Enterococcus faecalis, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, og Lactobacillus johnsonii 21,23.
En alternativ og eksperimentelt forskjellig metode for å inkludere ncAAs i RiPPs er stop codon undertrykkelse (SCS)24. For dette, en ortogonale tRNA / aminoacyl-tRNA synthetase (aaRS) paret er nødvendig for tilsvarende ncAA. Ideelt sett, alle disse tre komponentene er bioorthogonal, dvs. de ikke samhandle med endogene tRNAs og aaRSs. En ncAA-spesifikke aaRS kan genereres ved endring av enzymet aktive området og screening av genetisk biblioteker av muterte synthetases25. Videre krever innføring av en ncAA en codon som tildeles og som ikke koder for cAA. Gul stopp codon er vanligvis brukt24,26.
Nylig ble SPI etablert for inkorporering av α-chloroacetamide-som inneholder og klikk-kjemi-kompatible ncAAs NisA27. For eksempel ble Nε– alloc-lysine innlemmet i lasso peptid captistruin med områdespesifikke (SCS), rester-spesifikke (SPI) inkorporering metoder og senere endret i vitro av selskapets-katalysert metathesis28 . I forhold til SPI, metoden SCS er mer komplisert siden en ortogonale tRNA / aaRS par må være co uttrykt. Hittil, o-par for proline innlemmelse vært utviklet29, men beste av vår kunnskap, ingen eksempel proline analoge selskap har blitt rapportert.
Det bør bemerkes at ikke alle ncAAs kan inkluderes ved hjelp av SPI-metode. Først er opptaket av ncAAs i cytoplasma regulert av en rekke transport proteiner som er innebygd i cytoplasmatiske membran, som er den indre membranen for Gram-negative bakterier som E. coli. Normalt er E. coli i stand til å transportere en rekke aminosyre analogs i cellen med siden kjeder strukturelt og kjemisk ligner kanoniske aminosyrer. Andre, mange kjemisk reaktivere eller ustabil ncAAs kan fungere som en hemmer mot mobilnettet vekst, som de er giftige for metabolisme og fysiologi av verten celle30. Derfor bør opptak og toksisitet av ncAA for produksjon verten testes på forhånd. For å unngå inaktivering av PTM maskiner som en bivirkning, en strengt kontrollert uttrykk oppsett av ansvarlig genene kan brukes å innlemme naturlige aminosyren i endring enzymer (f.eks nisBC) og svømming i målet genet ( f.eks nisA). Dette kan gjøres ved hjelp av to ulike arrangører og induksjon av målet genuttrykk, som vist i spesialdesignet SPI protokoller31. Som beskrevet ovenfor, bruker metoden SPI avslappet substrat spesifisiteten av aaRS, som gjør at ncAA aktivisering og beslektet tRNA lading. Senere, leveres tRNA til ribosom etterfulgt av amid bond dannelse og folding av målet (poly) peptid. I denne prosesser, kan korrekturlesing og redigering mekanismer bli aktuelle32. For disse grunner, er det av stor betydning for har et mål ncAA strukturelt og kjemisk lik cAA. Andre viktige punkter er tilstrekkelig stabilitet (både i vekst media og utsatt for mobilnettet stoffskiftet) og Løseligheten av ncAA. I tillegg bør det være enten kommersielt tilgjengelig eller lett å være syntetisk kjemisk.
Her beskriver vi en protokoll for SPI, slik at rester-spesifikke inkorporering av ncAAs rekombinant RiPPs. Spesielt, ulike proline analogs er innlemmet i antimikrobielle peptid nisin A med E. coli som vert organisme. Massespektrometri brukes til å bekrefte aminosyren erstatning og peptid produkter er analysert for bioactivity vekst hemming analyser og fluorescens mikroskopi bruker mikrobiell indikator stammer.
Det grunnleggende kravet for vellykket rekombinant nisin uttrykk med definerte ncAAs krever en egnet proline auxotrophic E. coli belastning. For dette auxotrophy, proA må være dysfunksjonelle, for eksempel oppnådd av genomisk knockout. Celler fullt fratatt intracellulær Pro biosyntesen (dvs. sletting av proABC) uten mulighet for hjemfall er stabil auxotrophs. Brukte genet knockout metoder er phage signaltransduksjon eller single-genet knockout etter Datsenko & Wanner33. Videre kan proA knockout stammer fås fra offentlige repositories som Addgene, CGSC eller samlingen Keio. Siden rekombinant nisABC uttrykket vises her, avhengig av bruk av T7 arrangører, har uttrykk vert belastningen å bære en induserbart genet for T7 RNA polymerase. Dette kan oppnås ved innføring av λDE3 prophage i vert genomet, for eksempel ved hjelp av kommersielle kit. Belastninger BL21(DE3) kan eventuelt gjøres auxotrophic som beskrevet ovenfor.
Bruker SPI for innsetting av proline analogs, kan målrettet nisin strukturer vesentlig endre, opprette romanen peptid varianter med unik bokstavkombinasjon kombinasjoner og kjemiske egenskaper. Dette kan grunnleggende grensen på klassisk genteknologi omgås, og som er begrenset til side kjede kjemikalier av de 20 cAAs. I vivo kjemiske diversifisering av nisin som eksemplifisert ovenfor viser en generell tilnærming å utfylle naturlig PTMs og dramatisk forbedre kjemiske løpet av RiPPs. Vi tror at utvide repertoaret av naturlige aminosyrer har store løftet spesielt for forsterkere. I proteiner, kan et enormt utvalg av funksjonaliteten realiseres gjennom en definert arrangement av de 20 cAAs i tredimensjonale strukturer. Med bare 7-100 aa i lengden3være måter å oppnå strukturelle funksjoner bare gjennom cAAs begrenset for forsterkere. Det er derfor ikke overraskende at naturlig forsterkere i form av RiPPs er vanligvis mye post-translationally endret4. På samme måte, ncAAs som alternative byggeklosser holde store løftet å forbedre deres Farmakodynamiske og farmakokinetiske parametere (se Baumann et al. 201735 og referanser der).
SPI-metodene som er brukt i dette arbeidet fordeler en relativt enkelt eksperimentelle oppsett og grei kjøring av høy reproduserbarhet. På grunn av global substitusjon er multisite ncAA inkorporering målet peptider også mulig. På den annen side, kan metoden ikke være tilstrekkelig for utskifting av aminosyrer som ofte forekommer i målet gene produktet. I prinsippet, uønskede posisjoner kan endres av området-rettet mutagenese, men disse endringer kan også påvirke flere AMP egenskaper inkludert struktur og bioactivity. Når en auxotrophic belastning for produksjon er tilgjengelig, kan flere ncAAs testes uten omfattende endringer på genetisk nivå. Videre metoden er ikke begrenset til auxotrophic E. coli stammer, men kan også utføres ved hjelp av naturlig vanillin verten. For eksempel Zhou et al. viste at SPI for produksjon av romanen RiPPs fungerer også i den naturlig Trp-auxotroph L. lactis: bruker definert medier, tre tryptofan analogs ble innlemmet i fire posisjoner i nisin50.
Siden SPI metoden fører til global utskifting av utvalgte cAA av ncAA, er det generelt gjelder for et bredt spekter av målet peptider og proteiner. Et utvalg av auxotrophic E. coli stammer er tilgjengelig (se trinn 1), slik at flere cAAs hver skal testes for utskifting av ncAAs. Møtte analogs innlemmet bruke metA-mangelfull stammer (f.eks B834(DE3)) er vanligvis ansatt. Eksempler på isostructural Met analoger er azidohomoalanine (Aha) og homopropargylglycine (Hpg), kommersielt tilgjengelig ncAAs som kan innlemmes effektivt. Begge introdusere bioorthogonal håndtak som tillater vedlegg molekyler bærer en kompatibel alkyne eller azide funksjonalitet, henholdsvis. For eksempel fluorescerende fargestoffer eller polyetylenglykol (PEG) moieties kan festes av kobber (I)-katalysert azide alkyne cycloaddition (CuAAC)51.
Selv om begge rekombinant ncAA innlemmelse metoder (SPI og SCS) vanligvis oppnå tilstrekkelig målet antall, gir ofte redusert i forhold til vill-type produksjon av tilsvarende peptider og proteiner. Som purities korrelerer ofte med produksjonseffektivitet, kan ekstra rensing trinnene være nødvendig, særlig for lav-rikelig arter. I dette tilfellet av rekombinant nisin produksjon forenkler hans-merket leder sekvensen RiPP rensing av selektiv berikelse fra celle lysates. Rensing i denne protokollen forbedrer renhet og konsentrasjonen av nisin, men ofte gir ikke AMP purities nok å finne avkastningen og aktiviteten. I tillegg IMAC, brukte AMP rensing metoder omfatter HPLC, ionebytte kromatografi (IEC) og nedbør (f.eks. med aceton eller Trekloredikksyre (TCA)) eller kombinasjoner av disse – som resulterer i en må rensing ordningen52 . Det bør bemerkes at deres ofte polycationic natur kan rette IEC rensing. Frysetørring brukes ofte til å lagre renset forsterkere.
Ideelt sett ncAAs for inkorporering forsterkere skal være kommersielt tilgjengelig til rimelige priser eller produsert enkelt av enkel og reproduserbar syntese protokoller. En like viktig forutsetning for metoden SPI er at ncAA er anerkjent, aktivert og belastet på beslektet tRNA av endogene eller co uttrykt aaRS. Dette kan være testet i vitro av aminosyre aktivisering eller tRNA aminoacylation analysen53. Som et enkelt alternativ, SPI test uttrykk for modell proteiner som grønne fluorescerende protein (GFP) utført både tilstedeværelse og i fravær av ncAA tilskudd kan utføres. Videre oppløselighet i vekst medium og celle permeabilitet samt kjemiske stabilitet utgjør viktige faktorer.
I dette eksemplet ble antimikrobielle aktiviteten vist ved hjelp av en Gram-positive indikator belastning. Som den uttrykker leder peptidase NisP, er det siste trinnet i nisin modning katalysert. Fjerning av leder sekvensen (hans-merket for rensing formål) kan også være utført i vitro av behandling med renset NisP50 eller trypsin54. Utenfor omfanget av dette arbeidet, kan sykdomsfremkallende organismer og multidrug resistente stammer deretter bli testet for bakteriostatisk eller bakteriedrepende hemming av forsterkere bruker en lignende metode. Klinisk relevante mål arter omfatter MRSA, MDR Mycobacterium tuberculosis, VRE, Acinetobacter baumannii, Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa og Klebsiella pneumoniae. Foruten agar plate spredningen analysen presenteres her, vekst hemming kan også utføres ved hjelp av flytende mediefil inokulert med bakteriell arter og supplert med AMP. Bruke kjøttkraft fortynning metoder, kan minimal inhibitoriske konsentrasjon (MIC) bestemmes ren peptider55. Aktivitet analysen presenteres her kan også brukes til å beregne bioactivity og styrke av AMP inneholder løsninger i forhold til referanse forbindelser, for eksempel kommersielt tilgjengelige nisin.
Rekombinant produksjon av RiPPs er ofte mulig39, som vanligvis inkluderer co uttrykk for PTM gener. Så snart produksjon belastningen er overført til en kjemisk definert eller syntetiske minimal medium som inneholder en egnet ncAA, foregår rest-spesifikke utskifting av tilhørende cAA. Dermed kan andre RiPPs bli produsert av samme metodikken, forutsatt at rekombinant produksjonen er mulig og forhold kan finnes der ncAA innlemmelse og PTM gir tilstrekkelig mengder mål produktet. Merk at i tillegg til verten celle proteom peptid PTM maskiner kan også bli ncAA endret under SPI. Følgelig kan tidspunktet for målet uttrykk induksjon og lengden på følgende inkubasjonstiden kreve optimalisering. Siden ncAA inkorporering PTM enzymene kan påvirke deres stabilitet og aktivitet, kan produksjon av behandlet RiPP i prinsippet påvirkes. Tilstrekkelig PTM enzym effekt angis med dannelsen av behandlet prepeptide, som oppdaget av MS og bioactivity analyser. Som introdusert ovenfor, forskjellige induserbart arrangører kan brukes for å produsere PTM gener (i fravær av ncAA) etterfulgt av induksjon av forløperen peptid genet i nærvær av ncAA. Generelt, må produksjon av cAA inneholder mål peptid undertrykkes før tillegg av ncAA, derfor tett undertrykkelse av forløperen genet er nødvendig. I denne protokollen oppnås dette av katabolske undertrykkelse gjennom tillegg av glukose til vekst medium. Spesielt siden de PTM enzymene kreves for prepeptide behandling kommer vanligvis fra en genetisk Fjern vert, kan uttrykk temperatur og codon bruk av tilsvarende genene kreve optimalisering om rekombinant produksjon ennå ikke er etablert. I prinsippet kan tilstedeværelsen av ncAAs i i prepeptide påvirke gjenkjennelse og behandling av PTM enzymer, ved nisin NisBC og NisP. For ncAA inkorporering forsterkere anbefales det derfor å utføre småskala uttrykk eksperimenter først å identifisere egnet expression forhold og pålitelighet av AMP aktivitet analysen.
The authors have nothing to disclose.
J.H.N., TB og MB erkjenner finansiering i EU FW7 programmet (SYNPEPTIDE). F.-js og T.F. erkjenner finansiering av Federal Utdannings og vitenskap (BMBF Program “HSP 2020”, TU-WIMIplus prosjektet SynTUBio) og tysk Research Foundation (Cluster of Excellence “Unifying konsepter i katalyse”).
sodium chloride | Carl Roth, Germany | P029 | |
guanidine hydrochloride | Carl Roth, Germany | 0035.2 | |
dipotassium hydrogen phosphate | Carl Roth, Germany | P749.3 | |
potassium dihydrogen phosphate | Carl Roth, Germany | 3904.3 | |
sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Carl Roth, Germany | K300.2 | |
disodium hydrogen phosphate | Carl Roth, Germany | P030.2 | |
L-alanine | Carl Roth, Germany | 3076.2 | |
L-arginine | Carl Roth, Germany | 3144.3 | |
L-asparagine monohydrate | Carl Roth, Germany | HN23.1 | |
L-aspartic acid | Carl Roth, Germany | T202.1 | |
L-cysteine | Carl Roth, Germany | 3467.3 | |
L-glutamine | Carl Roth, Germany | 3772.1 | |
L-glutamic acid | Carl Roth, Germany | 3774.1 | |
L-glycine | Carl Roth, Germany | 3187.3 | |
L-histidine | Carl Roth, Germany | 3852.3 | |
L-isoleucine | Carl Roth, Germany | 3922.3 | |
L-leucine | Carl Roth, Germany | 3984.3 | |
L-lysine monohydrate | Carl Roth, Germany | 4207.2 | |
L-methionine | Carl Roth, Germany | 9359.4 | |
L-phenylalanine | Carl Roth, Germany | 4491.2 | |
L-proline | Carl Roth, Germany | T205.3 | |
L-serine | Carl Roth, Germany | 4682.4 | |
L-threonine | Carl Roth, Germany | T206.2 | |
L-tryptophan | Carl Roth, Germany | 4858.2 | |
L-tyrosine | Carl Roth, Germany | T207.2 | |
L-valine | Carl Roth, Germany | 4879.4 | |
ammonium sulfate | Carl Roth, Germany | 3746.3 | |
magnesium sulfate | Carl Roth, Germany | 0261.2 | |
D-glucose | Carl Roth, Germany | 6780 | prepare a 20% (w/v) solution for addition into molten agar |
calcium chloride | Carl Roth, Germany | PN93.2 | |
iron(II) chloride | Sigma-Aldrich, Germany | 372870 | |
thiamine hydrochloride | Sigma-Aldrich, Germany | T1270 | |
biotin | Carl Roth, Germany | 3822.2 | |
copper(II) sulfate | Merck, Germany | 102792 | |
manganese(II) chloride | Carl Roth, Germany | KK36.2 | |
zinc chloride | Merck, Germany | 108816 | |
immonium orthomolybdate | Sigma-Aldrich, Germany | 277908 | |
glycerol | Carl Roth, Germany | 7533.3 | |
isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Sigma-Aldrich, Germany | I6758 | |
ampicillin sodium salt | Carl Roth, Germany | K029.5 | working concentration 100 µg/mL for E. coli, prepare 100 mg/mL stock in ddH2O |
kanamycin sulfate | Carl Roth, Germany | T832.2 | working concentration 50 µg/mL for E. coli, prepare 50 mg/mL stock in ddH2O |
chloramphenicol | Carl Roth, Germany | 3886.1 | working concentration 5 µg/mL for L. lactis, prepare 37 mg/mL stock in ethanol |
(4S)-fluoroproline | Bachem, Switzerland | F-3970 | |
(4R)-fluoroproline | Bachem, Switzerland | F-3975 | |
(4S)-hydroxyproline | Bachem, Switzerland | F-1395 | |
(4R)-hydroxyproline | Bachem, Switzerland | F-2980 | |
(4S)-methanoproline | chemically synthesized | ||
(4R)-methanoproline | chemically synthesized | ||
hydrochloric acid (HCl) | Carl Roth, Germany | P074.4 | |
ethanol | VWR, Germany | 20825.324 | |
M17-broth | Sigmal-Aldrich, Germany | 56156 | commercial product, see Terzaghi BE & Sandine WE, Appl Microbiol., 1975, 29(6):807-13 for contents and preparation |
agar-agar | Carl Roth, Germany | 5210.5 | |
Nisin from Lactococcus lactis | Sigma-Aldrich, Germany | N5764 | commercial product, can be used as reference for bioactivity |
dimethyl sulfoxide (DMSO) | Carl Roth, Germany | A994.1 | |
imidazole | Carl Roth, Germany | 3899.3 | |
1.5 mL autosampler vial for LC-MS | Sigma-Aldrich, Germany | Supelco 854165 | |
acetonitrile | VWR, Germany | HiPerSolv CHROMANORM ULTRA for LC-MS, 83642 | LC-MS grade required |
formic acid | VWR, Germany | HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS, 84865 | LC-MS grade required |
1 mL Ni-NTA IMAC column, e.g. HisTrap FF Crude | GE Healthcare, UK | 29-0486-31 | different manufacturers and resins available for IMAC |
0.45 µm bottle top filter unit | VWR, Germany | 10040-470 | sterile filtration of solutions using a vacuum pump |
0.45 µm syringe filter PVDF membrane | Carl Roth, Germany | CCY1.1 | sterile filtration of solutions using a syringe and to remove particles from cell lysates |
luer-lock syringe, PP, 50 ml | Carl Roth, Germany | T552.2 | sterile filtration of solutions |
1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf, Germany | 30120086 | |
petri dishes (polystyrene, sterile) | Carl Roth, Germany | TA19 | |
Nile red | Sigma-Aldrich, Germany | 72485 | |
E. coli ΔproA strain | CGSC, Keio collection | JW0233-2 | proline-auxotrophic E. coli K-12 strain |
E. coli B834(DE3) | Novagen (Merck), Germany | 69041 | methionine-auxotrophic E. coli B strain |
λDE3 Lysogenization Kit | Novagen (Merck), Germany | 69734-3 | |
Lactococcus lactis NZ9000 pNG nisPT | bacterial indicator strain, see Khusainov R & Kuipers OP, PLoS One, 8 (9), e74890 | ||
benchtop centrifuge for 1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf, Germany | 5427 R | |
peristaltic pump | GE Healthcare, UK | P1 | |
FPLC system | GE Healthcare, UK | Äkta Purifier 10 or the like | |
inverted microscope | Nikon | TI Eclipse wide-field fluorescence microscope with 100x (N.A. 1.4) objective and Mercury Lamp | example setup for fluorescence microscopy |
electron multiplying CCD (EMCCD) camera | Andor Technologies, UK | Andor Luca | example setup for fluorescence microscopy |
fluorescence excitation filter | Thorlabs, USA | Dichroic cube (TLV-U-MF2-TRITC) | example setup for fluorescence microscopy |
fluorescence emission filter | AHF Analysentechnik, Germany | T 560 LPXR | example setup for fluorescence microscopy |
cover slip 24 x 60 mm | Carl Roth, Germany | LH26.1 | example setup for fluorescence microscopy |
Immersion Oil | Carl Zeiss, Germany | Immersol 518 F | example setup for fluorescence microscopy |
probe sonicator | Bandelin, Germany | Sonopuls HD3200 with sonotrode MS-72 | 200 W maximum HF output |
C5 HPLC column (2.1×100 mm, 3 µm particle size) | Sigma-Aldrich, Germany | 567227-U | example setup for mass spectrometry |
ESI-TOF coupled to HPLC system | Agilent, USA | Agilent 6530 Accurate Mass QTOF with 1260 HPLC | example setup for mass spectrometry |