Eine Drosophila In Vivo Verletzungen Modell für das Studium Neuroregeneration in den peripheren und zentralen Nervensystems
Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll mit der Drosophila sensorischen Neuron – dendritischen Arborization (da) Verletzungen Modell Neuron, das in Vivo verbindet live imaging, zwei-Photonen-Laser Axotomie/Dendriotomy und die mächtigen fliegen genetische Toolbox, als eine Plattform für das screening potenzieller Projektträger und Inhibitoren der Neuroregeneration.
Abstract
Die nachwachsen Kapazität des beschädigten Nervenzellen regelt Neuroregeneration und funktionelle Wiederherstellung nach Trauma Nervensystem. In den letzten Jahrzehnten wurden verschiedene intrinsische und extrinsische hemmende Faktoren bei der Einschränkung der Axon Regeneration identifiziert. Jedoch reicht nicht einfach entfernen diese hemmenden Hinweise für erfolgreiche Regeneration, zeigt das Vorhandensein von zusätzlichen regulatorischen Maschinen. Drosophila Melanogaster, Drosophila, teilt sich evolutionär konservierte Gene und Signalwege mit Wirbeltiere, einschließlich des Menschen. Die Kombination der starke genetische Toolbox von Fliegen mit zwei-Photonen-Laser Axotomie/Dendriotomy, beschreiben wir hier die Drosophila sensorischen Neuron – dendritischen Arborization (da) Verletzungen Modell Neuron als Plattform für das screening von systematisch für Roman Regeneration-Regulatoren. Kurz, beinhaltet dieses Paradigma (a) die Vorbereitung der Larven, (b) Läsion Induktion, Dendrite(s) oder Axon(s) mit einem zwei-Photonen-Laser, c) lebende confocal imaging posttraumatischen und (d) Datenanalyse. Unser Modell ermöglicht hoch reproduzierbare Verletzungen single beschrifteten Neuronen Axone und Dendriten der klar definierte neuronale Subtypen im peripheren und zentralen Nervensystems.
Introduction
Die Unfähigkeit der Axone nach einer Schädigung des Zentralnervensystems (ZNS), regenerieren kann zu dauerhaften Behinderungen bei Patienten führen, und spielt auch eine Rolle in der irreversiblen neurologischen Defiziten in Neurodegenerative Krankheiten1,2 ,3,4,5. Die CNS-Umwelt, sowie die Fähigkeit der inneren Wachstum von Neuronen, bestimmt, ob Axone sind in der Lage, nach dem Trauma zu regenerieren. Extrazelluläre Faktoren von Oligodendrozyt, Astroglial und handelt Quellen haben gezeigt, dass neuronale Wachstum4,6,7,8, sondern die Beseitigung dieser Moleküle zu behindern nur ermöglicht für begrenzte sprießen5. Intrinsische Regeneration Signale beeinflussen regenerativen Erfolg5,9 und mögliche therapeutische Ziele zu vertreten, aber diese Prozesse auf molekularer Ebene noch nicht gut definiert sind. Erhöhung der trophischen Faktor Signalisierung oder Beseitigung von endogenen Bremsen, wie z. B. die Pten Phosphatase10können bei axonalen Regeneration unter bestimmten Umständen führen. Kombinationen verschiedener Methoden individuell wirksam erwiesen bieten auch nur begrenzte allgemeine Erholung bisher11,12,13,14. Deshalb dringend zusätzliche Wege für eine gezielte Therapie zu identifizieren. Neben der Einleitung eines Axon Regrowth ob und wie die Axone umverdrahtet werden an das richtige Ziel, Reform Synapse Spezifität und erreichen Funktionelle Wiederherstellung sind wichtige Fragen unbeantwortet.
Zusammenfassend lässt sich sagen ist Stand der Erkenntnisse über die Maschinen diktieren Axon Regeneration noch sehr lückenhaft. Ein Teil des Problems ist die technische Schwierigkeit des Studiums Axon Regeneration bei Säugetieren in Echtzeit, ein Ansatz, kostspielig, zeitaufwändig und anspruchsvoll für die Durchführung von umfangreichen genetischen Bildschirme ist. Drosophila Melanogaster, andererseits, erweist sich ein außerordentlich leistungsfähiges System für die Untersuchung von komplexen biologischen Fragen. Die Fruchtfliege war maßgeblich an der Definition von Genen und Signalwege, die auffallend beim Menschen konserviert sind und wurde ein erfolgreiches Modell für die Erforschung der menschlichen Bedingungen, z. B. neurodegenerativer Erkrankungen, durch die riesige Molekulargenetik-Werkzeuge gen Funktion15bearbeiten zur Verfügung. Insbesondere gelten Fruchtfliegen als ein ideales Werkzeug für die Entdeckung von Genen, die in den neuronalen Verletzungen und nachwachsen15,16. Mehrere Fliegen neuronalen Verletzung Modelle wurden entwickelt, einschließlich der Erwachsenen-Kopf oder Larven ventrale Nerv Schnur (VNC) stechen mit Nadeln, larval VNC oder Nerv Crush mit Zange, larval Neuron Laser Axotomie, olfaktorischen Rezeptor Neuron Entfernung Explantaten Hirnverletzungen, und peripheren Nerven Läsion durch Flügel Abfindung15,17,18,19,20,21,22,23. Aufregend, haben neuere Arbeit mit Drosophila Verletzungen Modelle erweitert unser Verständnis der zellulären und genetischen Wege durch das Nervensystem zum reagieren auf neuronalen Verletzungen, von denen einige gezeigt worden, um bei Säugetieren24 konserviert werden ,25. Wieder betont dies das diesem Modellorganismus für die Identifizierung neuartiger Mechanismen der neuronalen Reparatur-Dienstprogramm.
Hier beschriebene ist ein zwei-Photon Laser-basierten Drosophila Larven sensorischen Neuron Verletzungen Modell. Ein zwei-Photonen-Laser wurde zuerst verwendet, um Axone im Zebrafisch in Vivo in 200326geschnitten. Im selben Jahr wurde der erste Laser-Dendriotomy in Drosophila mit einem gepulsten Stickstoff Laser27aufgeführt. Kurz danach verwendet mehrere C. Elegans Labore Femtosekundenlaser, um Modelle von Axon Regeneration28zu etablieren. Im Jahr 2007 Wu und Kollegen verglichen und die Unterschiede zwischen Laser Verletzungen in C. Elegans induziert durch verschiedene Arten von Laser-29gemeldet. Im Jahr 2010 wurde Axon Regeneration nach Laser Axotomie erstmals gezeigt in Drosophila30auftreten. Aufbauend auf dieser umfangreichen Laser Verletzungen Literatur, entwickelten wir eine Fliege neuronalen Verletzungen-Modell mit der zwei-Photonen-Laser, der präzise Induktion Verletzungsgefahr für Ziel-Websites mit minimaler Störung benachbarter Gewebe ermöglicht, bietet eine relativ saubere System, die inneren und äußeren Eigenschaften der Neuroregeneration mit einzelligen Auflösung zu studieren. Insbesondere haben wir sowohl im peripheren Nervensystem (PNS) eine Reihe von Verletzungen Methoden zur sensorischen Neuronen dendritischen Arborization (da) gegründet und ZNS. Da Neuronen können in vier verschiedene Klassen zeichnen sich in erster Linie durch ihre Dendriten verzweigen Komplexität gruppiert werden: Klasse I bis IV31. Unsere veröffentlichten Arbeiten zeigen, dass da Neuron Regeneration Säugetier-Verletzungen Modelle phänotypische und molekulare Ebene ähnelt: da Neuronen spezifische Regeneration Klasseneigenschaften mit Klasse IV angezeigt, aber nicht Klasse I oder III da Neuronen ausstellenden Regeneration in der PNS; Klasse IV da Neuronen Axone regenerieren robust in der Peripherie, sondern ihr regeneratives Potential wird deutlich reduziert, im ZNS, so ähnlich Dorsal Root Ganglion (DRG) Neuronen bei Säugetieren; Verbesserung der mTOR Aktivität über Pten verbessert Löschung oder Akt Überexpression Axon Regeneration in der Fliege CNS19. Mit Hilfe dieser Verletzung Modell, wir haben Durchführung von genetischen Bildschirme und identifiziert RNA Verarbeitung Enzym Rtca als evolutionär konservierte hemmenden Faktor für Axon Regeneration, Verknüpfung von Axon Verletzungen mit zellulären Stresses und RNA-Modifikation20 .
Im vorgestellten-Paradigma wird die Verletzung per Laser Axotomie/Dendriotomy Larven Klasse IV oder III da Neuronen, gekennzeichnet durch Ppk-CD4-TdGFP oder 19 12 Gal4, UAS-CD4-TdGFP, Repo-Gal80, bzw. induziert. Die Schädigung erfolgt auf 2Nd , 3rd Instar Larven bei rund 48-72 h nach der Eiablage (h AEL). PNS richtet Axotomie Läsion zum Abschnitt Axon ~ 20-50 µm vom Zellkörper, CNS Axotomie auf einer Fläche von ~ 20 µm im Durchmesser an der Kommissur-Kreuzung in die VNC und Dendriotomy zu den primären dendritische Verzweigung Punkten. Die gleichen Neuron abgebildet in 8-24 h nach einer Verletzung (AI), vollständige Durchtrennung zu bestätigen und in 48-72 h AI Regeneration zu beurteilen. Durch Time-Lapse confocal Imaging können die Degeneration und Regeneration der einzelnen Axone/Dendriten, die verletzten in Vivo wurden im Laufe der Zeit überwacht werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Beim Einrichten von Fly kreuzt, variieren je nach den Genotypen und die Anzahl der Larven für bestimmte Experimente benötigt die Anzahl der Weibchen und Männchen verwendet. Für WT fliegen nutzt typische Kreuz 10 Hündinnen und 5 Rüden. Das Sammlungsfenster kann eingeschränkt werden, abhängig von der Genauigkeit der Larven Alter erforderlich. Beispielsweise wird ein 2-h Abholfrist Larven einer homogeneren Bevölkerung Ausbeute. In diesem Fall hilft mit 20 oder mehr jungfräulichen Weibchen die Kreuze einrichten aus…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Jessica Goldshteyn für den technischen Support. Arbeit im Labor Song wird von der NIH Grant R00NS088211, und die intellektuelle und Developmental Disabilities Research Center (IDDRC) neue Program Development Award finanziert.
Materials
| Diethyl ether, ACS reagent, anhydrous | Acros Organics | AC615080010 | |
| Halocarbon 27 Oil | Genesee Scientific | 59-133 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), 20x Concentrate, pH 7.5, supplier # E703-1L | VWR | 97062-948 | |
| Agar powder, Alfa Aesar, 500GM | VWR | AAA10752-36 | |
| Grape juice | Welch’s | ||
| Ethanol 95% (Reagent Alcohol 95%) | VWR | 64-17-5 | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Propionic Acid | J.T.Baker | U33007 | |
| Cover Glasses: Rectangles | Fisher Scientific | 12-544-D | 50 mm X 22 mm |
| Zeiss LSM 880 laser scanning microscope | Zeiss | ||
| Zen software | Zeiss | ||
| Chameleon Ultra II | Coherent |
References
- Yakura, J. S. . Recovery following spinal cord injury. , (1996).
- Harel, N. Y., Strittmatter, S. M. Can regenerating axons recapitulate developmental guidance during recovery from spinal cord injury?. Nature reviews. Neuroscience. 7, 603-616 (2006).
- Jurewicz, A., Matysiak, M., Raine, C. S., Selmaj, K. Soluble Nogo-A, an inhibitor of axonal regeneration, as a biomarker for multiple sclerosis. Neurology. 68, 283-287 (2007).
- Yiu, G., He, Z. Glial inhibition of CNS axon regeneration. Nat Rev Neurosci. 7, 617-627 (2006).
- Sun, F., He, Z. Neuronal intrinsic barriers for axon regeneration in the adult CNS. Curr Opin Neurobiol. , (2010).
- Liu, B. P., Cafferty, W. B., Budel, S. O., Strittmatter, S. M. Extracellular regulators of axonal growth in the adult central nervous system. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 361, 1593-1610 (2006).
- Liu, K., Tedeschi, A., Park, K. K., He, Z. Neuronal intrinsic mechanisms of axon regeneration. Annu Rev Neurosci. 34, 131-152 (2011).
- Schwab, M. E., Strittmatter, S. M. Nogo limits neural plasticity and recovery from injury. Curr Opin Neurobiol. 27, 53-60 (2014).
- He, Z., Jin, Y. Intrinsic Control of Axon Regeneration. Neuron. 90, 437-451 (2016).
- Park, K. K., et al. Promoting axon regeneration in the adult CNS by modulation of the PTEN/mTOR pathway. Science. 322, 963-966 (2008).
- Geoffroy, C. G., Hilton, B. J., Tetzlaff, W., Zheng, B. Evidence for an Age-Dependent Decline in Axon Regeneration in the Adult Mammalian Central Nervous System. Cell Rep. 15, 238-246 (2016).
- Geoffroy, C. G., et al. Effects of PTEN and Nogo Codeletion on Corticospinal Axon Sprouting and Regeneration in Mice. J Neurosci. 35, 6413-6428 (2015).
- Jin, D., et al. Restoration of skilled locomotion by sprouting corticospinal axons induced by co-deletion of PTEN and SOCS3. Nat Commun. 6, 8074 (2015).
- Wang, X., et al. Axonal regeneration induced by blockade of glial inhibitors coupled with activation of intrinsic neuronal growth pathways. Exp Neurol. 237, 55-69 (2012).
- Fang, Y., Bonini, N. M. Axon degeneration and regeneration: insights from Drosophila models of nerve injury. Annual review of cell and developmental biology. 28, 575-597 (2012).
- Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72, 202-230 (2011).
- Leyssen, M., et al. Amyloid precursor protein promotes post-developmental neurite arborization in the Drosophila brain. The EMBO journal. 24, 2944-2955 (2005).
- MacDonald, J. M., et al. The Drosophila cell corpse engulfment receptor Draper mediates glial clearance of severed axons. Neuron. 50, 869-881 (2006).
- Song, Y., et al. Regeneration of Drosophila sensory neuron axons and dendrites is regulated by the Akt pathway involving Pten and microRNA bantam. Genes Dev. 26, 1612-1625 (2012).
- Song, Y., et al. Regulation of axon regeneration by the RNA repair and splicing pathway. Nat Neurosci. 18, 817-825 (2015).
- Kato, K., Forero, M. G., Fenton, J. C., Hidalgo, A. The glial regenerative response to central nervous system injury is enabled by pros-notch and pros-NFkappaB feedback. PLoS Biol. 9, e1001133 (2011).
- Fang, Y., Soares, L., Teng, X., Geary, M., Bonini, N. M. A novel Drosophila model of nerve injury reveals an essential role of Nmnat in maintaining axonal integrity. Curr Biol. 22, 590-595 (2012).
- Xiong, X., et al. Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury. J Cell Biol. 191, 211-223 (2010).
- Brace, E. J., DiAntonio, A. Models of axon regeneration in Drosophila. Exp Neurol. 287, 310-317 (2017).
- Hao, Y., Collins, C. Intrinsic mechanisms for axon regeneration: insights from injured axons in Drosophila. Curr Opin Genet Dev. 44, 84-91 (2017).
- Galbraith, J. A., Terasaki, M. Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation. Mol Biol Cell. 14, 1808-1817 (2003).
- Sugimura, K., et al. Distinct developmental modes and lesion-induced reactions of dendrites of two classes of Drosophila sensory neurons. J Neurosci. 23, 3752-3760 (2003).
- Yanik, M. F., et al. Neurosurgery: functional regeneration after laser axotomy. Nature. 432, 822 (2004).
- Wu, Z., et al. Caenorhabditis elegans neuronal regeneration is influenced by life stage, ephrin signaling, and synaptic branching. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 15132-15137 (2007).
- Stone, M. C., Nguyen, M. M., Tao, J., Allender, D. L., Rolls, M. M. Global up-regulation of microtubule dynamics and polarity reversal during regeneration of an axon from a dendrite. Mol Biol Cell. 21, 767-777 (2010).
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129, 2867-2878 (2002).
- Kang, H., Lichtman, J. W. Motor axon regeneration and muscle reinnervation in young adult and aged animals. J Neurosci. 33, 19480-19491 (2013).
- Duan, X., et al. Subtype-specific regeneration of retinal ganglion cells following axotomy: effects of osteopontin and mTOR signaling. Neuron. 85, 1244-1256 (2015).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
- Grueber, W. B., et al. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134, 55-64 (2007).
- Buss, A., et al. NG2 and phosphacan are present in the astroglial scar after human traumatic spinal cord injury. BMC Neurol. 9, 32 (2009).
- McKeon, R. J., Jurynec, M. J., Buck, C. R. The chondroitin sulfate proteoglycans neurocan and phosphacan are expressed by reactive astrocytes in the chronic CNS glial scar. J Neurosci. 19, 10778-10788 (1999).
- Raabe, I., Vogel, S. K., Peychl, J., Tolic-Norrelykke, I. M. Intracellular nanosurgery and cell enucleation using a picosecond laser. J Microsc. 234, 1-8 (2009).
- Hutson, M. S., Ma, X. Plasma and cavitation dynamics during pulsed laser microsurgery in vivo. Phys Rev Lett. 99, 158104 (2007).
- Venugopalan, V., Guerra, A., Nahen, K., Vogel, A. Role of laser-induced plasma formation in pulsed cellular microsurgery and micromanipulation. Phys Rev Lett. 88, 078103 (2002).
- Bourgeois, F., Ben-Yakar, A. Femtosecond laser nanoaxotomy properties and their effect on axonal recovery in C. elegans. Opt Express. 16, 5963 (2008).
- O’Brien, G. S., et al. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J Vis Exp. , (2009).
- Tsai, P. S., et al. Plasma-mediated ablation: an optical tool for submicrometer surgery on neuronal and vascular systems. Curr Opin Biotechnol. 20, 90-99 (2009).
- Chung, S. H., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mazur, E., Samuel, A. D. The role of the AFD neuron in C. elegans thermotaxis analyzed using femtosecond laser ablation. BMC Neurosci. 7, 30 (2006).
- Williams, W., Nix, P., Bastiani, M. Constructing a low-budget laser axotomy system to study axon regeneration in C. elegans. J Vis Exp. , (2011).
