超声引导组织定向细胞植入术在生物学相关转移性肿瘤移植中的应用
Summary
在这里, 我们提出了一个协议, 利用超声引导注射神经母细胞瘤 (NB) 和尤文的肉瘤 (ES) 干细胞 (已建立的细胞系和病人派生的肿瘤细胞) 在生物相关的网站, 以创建可靠的前模型癌症研究。
Abstract
抗癌疗法的临床前试验依赖于类似于癌症先天倾向的异种异体模型。标准皮下侧面模型的优点包括程序性缓解和监测肿瘤进展和反应的能力, 没有侵袭性成像。这种模型往往是不一致的转化临床试验, 并具有有限的生物学相关特性与低倾向于产生转移, 因为缺乏一个本土的微环境。相比之下, 原生肿瘤部位的同种异体原位移植模型可以模拟肿瘤微环境, 复制远处转移扩散等重要疾病特征。这些模型往往需要繁琐的手术程序, 延长麻醉时间和恢复期。为了解决这一问题, 癌症研究人员最近利用超声引导注射技术建立了用于临床前实验的癌症异种模型, 从而可以快速可靠地建立组织导向的小鼠模型。超声可视化也为肿瘤植入和生长的纵向评估提供了一种无创的方法。在这里, 我们描述了超声引导下注射癌细胞的方法, 利用肾上腺的 NB 和肾亚胶囊的 ES。这种微创方法克服了在组织特定部位的癌细胞在生长和转移中的繁琐开放性手术植入, 并消退了病态恢复期。我们描述了已建立的细胞系和病人的细胞系在原位注射的应用。预先制作的商业套件可用于肿瘤离解和荧光素酶标记细胞。用图像引导注射细胞悬浮液为临床前模型的建立提供了一个微创和可再生的平台。该方法用于为其他癌症 (如膀胱、肝脏和胰腺) 建立可靠的前置模型, 以此为许多癌症模型的未开发潜力提供依据。
Introduction
动物移植模型是新的抗癌治疗的前期研究的基本工具。标准的小鼠移植依赖于皮下侧植入细胞, 为监测肿瘤的生长提供了一个有效的、易于访问的场所。皮下模型的缺点是缺乏肿瘤特异性的生物学特性, 这可能限制其转移1的潜能。这种限制是通过使用同种异体原位移植来克服的, 肿瘤细胞被嫁接在当地的组织部位, 提供一个相关的微环境与转移电位2。同种异体原位移植模型保持原有的生物学特性, 为临床前药物发现提供可靠的模型3,4。用于组织定向植入的癌细胞要么是建立的细胞系, 要么是病人肿瘤的患者源细胞。从癌细胞系建立的异位移植可能表现出与原发性肿瘤的遗传差异很大, 与患者派生的移植性5相比。鉴于此, 建立患者源性同种异体原位移植已成为检测肿瘤药物发现新疗法的首选标准。
在儿科癌神经母细胞瘤 (nb), 原位移植模型重述原发肿瘤生物学和发展转移到典型的站点的 NB 传播6,7。NB 发育在肾上腺或沿旁交感神经链。最常见的原位植入方法需要开放的跨腹部手术程序。这种方法往往繁琐, 动物发病率高, 恢复期复杂。高分辨率超声最近被用于组织定向植入肿瘤细胞的发展, 几个小鼠模型的癌症研究8,9。该技术是可靠的, 可重复的, 高效的, 并安全的建立相关的转移瘤移植10,11。
以超声引导靶器官定位和针植入细胞系和患者源性肿瘤细胞为例, 建立儿童肿瘤移植术11。该技术用于小鼠肾上腺的 NB 靶向。尤文的肉瘤主要是一种骨癌, 常见于长骨, 如股骨和骨盆骨12。病例报告表明, 为了确定一个主要的骨癌的生长是否可行的肾脏组织, 一个肾亚囊的位置被选择为原位植入13。肿瘤细胞的肾小球囊细胞植入术是研究 ES14自发转移的一个有希望的模型。
Protocol
Representative Results
Discussion
超声引导下的铌和 ES 细胞植入术是建立可靠的小鼠移植物在肿瘤生物学基础研究中的有效和安全的方法。对超声引导组织靶向植入的成功至关重要的是, 训练有素的人员在解剖性地定位了感兴趣的器官和在立体定向注射肿瘤细胞方面具有专门知识。
肿瘤组织的分离被证明是发展描述的患者衍生异体移植模型的关键步骤。原生肿瘤组织包括细胞微环境和周围基质, 可能会影响肿…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了罗伯特伍德约翰逊基金会/阿莫斯医学教师发展计划, Taubman 研究所, 和美国密歇根大学儿科手术科的支持。作者希望感谢金柏 Converso-巴兰和马库斯博士 Jarboe 为协助与超声注射程序和成像平台。我们感谢保罗. 特朗布利为图图形提供的帮助。我们还感谢密歇根大学放射科使用的分子影像学中心和肿瘤影像核, 这部分是由综合癌症中心 NIH (P30 CA046592) 支持的。密歇根大学生理学分型核心部分由 NIH (OD016502) 和法兰克心血管中心资助。IDEXX RADIL 生物学研究设施, 哥伦比亚, 密苏里州进行了细胞线认证。我们感谢苔米斯托尔, Rajen 博士和莫特固体肿瘤肿瘤学项目。我们的病人和家人感谢他们的启发, 勇气和持续的支持我们的研究。
Materials
| Mice | |||
| NOD-SCID | Charles River | 394 | |
| NSG | The Jackson Laboratory | 5557 | |
| Cell Line | |||
| NB | |||
| IMR-32 | ATCC | CCL-127 | Established human neuroblastoma cell line |
| SH-SY5Y | ATCC | CRL-2266 | Established human neuroblastoma cell line |
| SK-N-Be2 | ATCC | CRL-2271 | Established human neuroblastoma cell line |
| ES | |||
| TC32 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| A673 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| CHLA-25 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| A4573 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| Cell Line media | |||
| RPMI | Life Technologies | 11875-093 | |
| Matrigel | BD BioSciences | 354234 | |
| Dissociation | |||
| Dissection Tools | KentScientific | INSMOUSEKIT | |
| Human Tumor Dissociation Kit | MACS Miltenyi Biotec | 130-095-929 | |
| gentleMACS dissociator | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| gentleMACS C tubes | MACS Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| Cell Strainer | Corning | 431751 | |
| Luciferase Tagging | |||
| Lenti-GFP1 virus | University of Michigan, Vector Core | Luciferase Virus | |
| Steady Glo-Luciferase Assay Kit | Promega | E2510 | |
| Bioluminescence Imaging | |||
| Ivis Spectrum Imaging System | PerkinElmer | 124262 | |
| D-Luciferin | Promega | E160X | |
| Anesthetic | |||
| Inhaled Isoflurane | Piramal Critical Care Inc | 66794-0017-25 | |
| Ultrasound Guided Injection | |||
| Vevo 2100 High Resolution Imaging | Vevo | 2100 | |
| Hamilton Syringes (27 gauge needle) | Hamilton | 80000 | |
| 22 Gauge Angiocatheter | BD Biosciences | 381423 | |
| Optical ointment | Major Pharmaceuticals | 301909 | |
| Nair | Church & Dwight Co | Hair Removal agent | |
| Aquasonic 100 Ultrasound Transmission gel | Parker | Ultrasound gel | |
| Histology | |||
| CD99 | DAKO | M3601 | Primary Antibody |
| Tyrosine Hydroxylase | Sigma-Aldrich | T2928 | Primary Antibody |
| Secondary HRP-Polymer antibody | Biocare | BRR4056KG | |
| Miscelleneous | |||
| 10 mL Pipettes | Fisher Scientific | 13-676-10J | |
| 5 mL Pipettes | Fisher Scientific | 13-676-10H | |
| 1.5 mL Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| P1000 pipette | Eppendorf | 3120000062 | |
| P200 pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| P1000 pipette tips | Fisher Scientific | 21-375E | |
| P200 pipette tips | Fisher Scientific | 21-375D | |
| Portable pipette aid | Drummond | 4-000-101 | |
| digital animal Weighing Scale | KentScientific | SCL-1015 | |
| Calipers | Fisher Scientific | 06-664-16 | |
| 6well low attachment plates | Corning | 07-200-601 | |
| 10 cm Tissue Culture Treated Dishes | Fisher Scientific | FB012924 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | TR-1003-G |
References
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