Intraportal трансплантация панкреатических островков в мышиной модели
Summary
Трансплантация поджелудочной островок является способом достижения нормогликемия в диабет типа 1. Эта статья посвящена трансплантации технику через intraportal маршрут для поддержания нормальной глюкозы в диабетических мышей.
Abstract
Трансплантация поджелудочной островок для снижения гипергликемии весьма успешным в грызунов с химически индуцированной сахарным диабетом. Наиболее распространенным сайт трансплантации в экспериментальной островок трансплантации является капсулу почки. Однако поскольку меньше известно о взаимодействии панкреатических островков с составляющих крови, также имеет смысл использовать подход воротной вены в экспериментальной островок пересадке.
Этот протокол демонстрирует метод трансплантации intraportal островок в ВММНИИ обнаженной мышей. Стрептозотоцин (180 мг/кг) вводят внутрибрюшинно побудить гипергликемии у получателей мышей. Они рассматриваются как диабетическая в пост-уровень глюкозы крови больше, чем 20 ммоль/л Один день до трансплантации, мыши панкреатических островков изолированы от доноров поджелудочной железы, коллагеназа пищеварения; как минимум 350 островков используются каждого диабетическая получателя. В зависимости от урожайности изоляции островок, два или более доноров мышей используются для каждого получателя. После ночи культуры при 37 ° C островки вводят в получателей печени через воротной вены. После операции, мышей были защищены в красных домов Makrolon и наблюдается до просыпаются. Этот протокол поддерживает гликемического контроля для 120 дней в сингенных мышей и 15 дней в аллогенной мышей.
Introduction
Островок трансплантация это перспективный подход для лечения 1 сахарный диабет типа1. В 1893 году Уотсон Уильямс была выполнена первая попытка перевести фрагмент поджелудочной железы овец в диабетических пациентов. Однако был достигнут крупный прорыв в клинической островок пересадке с протоколом Эдмонтон, и впоследствии ряд национальных программ были развитые2. В прошлом несколько сайтов, таких как костного мозга, Сальниковая сумка, внутримышечные региона, желудка слизистой поверхности, селезенки и капсула почек, были изучены в доклинических моделях, но Портал венозной системы рассматривается как одна из подходящие и эффективного сайта для клинических программ3,4,5,6.
Экзогенные администрации инсулина могут быть заменены островок вливания в воротной вены. Это считается предпочтительным местом, поскольку поступление кислорода сопоставима с родной поджелудочной железы из-за расположения ниже по течению впадения портала артерии и Вены. Кроме того существует большой площадью поверхности, так что трехмерной структуры островки могут быть сохранены, и васкуляризация может быть облегченной5. В получателей Диабетическая мышь, 2000 человека или свиных островковых эквиваленты или 350 мыши островков адекватны вспять гипергликемической государственная7,8. Euglycemic уровнях сообщалось на 15 дней в модели мыши получателя культивированная островков и аллогенной модели мышь и более чем 120 дней в сингенных мышь для трансплантации.
Факторы, касающиеся эффективности трансплантации островковых через воротной вены являются соответствующие анестезии, методом прокола и гемостаз9. Анестезии может быть вызвана ингаляции (5% изофлюрановая) или инъекции (кетамин, Ксилазина или Пентобарбитал), и вещества, часто сочетаются. Для контроля глубины и времени анестезии внимание следует уделять состояние мыши, такие как цвет слизистой, глаз крышкой, роговицы рефлекс, частота дыхания и температуру тела. Важно обеспечить что животное не борется и что он выживает операции. Температура может управляться различными нагревательными приборами, например, грелки, красный свет ламп, теплые термальные пластины и т.д. А был использован для поддержания температуры 25-30 ° c между мышью и таблицу операции, которая предотвращает возникновение гипотермии. Дозы обезболивающих средств важное значение, поскольку все они метаболизируются в печени, и функции печени может быть временно неупорядоченных инфузии островок подвеска. Точкой идеальный пункции воротной вены является позиция между первой и второй приток вен.
Количество островков и объем предполагаемых инъекций также повлиять на результаты трансплантации, как чрезмерный объем может увеличить напряжение сдвига. Объем 0,2 мл считаются подходящими для трансплантации островковых в воротной вены. Puncturing раны (26-иглы) вызывает кровотечение из воротной вены, который должен быть остановлен в своевременным и эффективным образом. Стерильные марлевые или палец может применяться с минимальным давлением в месте пункции для около 6 минут, чтобы остановить кровотечение. Взятых вместе, портал островок инъекции является эффективным и обеспечивает регулирование уровня глюкозы в крови в химически индуцированных диабетической мыши модели.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом исследовании intraportal маршрут трансплантации островковых изучается. Этот протокол является высокоэффективным в освобождении диабетической стресс и дает возможность углубленного изучения исследований трансплантации островковых. Этот протокол подтверждает, что около 350 мышиных …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы признать Гундула Hertl для ее поддержки.
Materials
| C57Bl/6 mice | Charles River (Sulzfeld, Germany) | (10-12 weeks) | |
| BALB/c mice | Charles River (Sulzfeld, Germany) | (10-12 weeks) | |
| NMRI nude mice | Charles River (Sulzfeld, Germany) | (10-12 weeks) | |
| Ketamine | Bela-pharm | ||
| Xylazine | CEVA TIERGESUNDHEIT GmbH | ||
| Syringe, 23G and 26G needle | BD | ||
| Petri Dish | Falcon | 303800 | |
| NaCl | Carl Roth | 351007 | |
| Sterile Gauze | Fuhrmann | 7647-14-5 | |
| Shaking Water bath | Kotterman | 1501 | |
| Scissors | Braun | 1501 | |
| Glucose Meter | One Touch | ||
| Warm Thermal Plate | Thermo Fisher | ||
| Braunol (povidone-iodide solution) | B.Braun Melsungen AG | 3864154 | |
| Liposic Edo – Sprinkled Ointment (eye ointment) | Dr. G Mann Chem.-Pharm. GmbH | ||
| Incubator | Fa. Roth | ||
| Flow Bench | Herdus | ||
| Ficoll | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| 5-0 Silk Suture Vicryl | Braun | (7.5 *1.75mm) | |
| Michel Clamps (clips) | Aesculap | BN507R | |
| P/FCS Solution | Gibco | 21180-021 | |
| TCM-199 (10x) | Gibco | 21180-021 | |
| FCS | Biowest | S1810-500 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| HEPES (1 M) | Biochrom | L 1613 | |
| Gentamycin | Ratiopharm | ||
| Ciprofloxacin | Fresenius Kabi | ||
| Hank's Solution | Gibco | 14060-040 | |
| Collagenase | Roche | 11213865001 | |
| Streptozotocin | Calbiochem | 572204 | |
| OPSITE-spray (wound healer) | Smith and nephew | 66004978 | |
| Reugular food | Altromin | ||
| Head light LED 16042 (magnifying glass) | Eschenbach | 16042 | |
| Rat anti-mouse PECAM-1(CD31) monoclonal primary antibody | Millipore, Chemicon | CBL1337 | Dilution (1:100) |
| Donkey anti-rat secondary antibody | Dianova | 712095153 | Dilution (1:400) |
| Polyclonal guinea pig anti-insulin primay antibody | Dako | A0564 | Dilution (1:500) |
| Donkey anti-guinea pig secondary antibody | Dianova | 706-259-148 | Dilution (1:400) |
References
- McCall, M., Shapiro, A. M. Update on islet transplantation. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (7), a007823 (2012).
- Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).
- Cantarelli, E., et al. Bone marrow as an alternative site for islet transplantation. Blood. 114 (20), 4566-4574 (2009).
- Echeverri, G. J., et al. Endoscopic gastric submucosal transplantation of islets (ENDO-STI): technique and initial results in diabetic pigs. American Journal of Transplantation. 9 (11), 2485-2496 (2009).
- Korsgren, O., et al. Optimising islet engraftment is critical for successful clinical islet transplantation. Diabetologia. 51 (2), 227-232 (2008).
- Merani, S., Toso, C., Emamaullee, J., Shapiro, A. M. Optimal implantation site for pancreatic islet transplantation. British Journal of Surgery. 95 (12), 1449-1461 (2008).
- Lingwal, N., et al. Inhibition of gelatinase B (matrix metalloprotease-9) activity reduces cellular inflammation and restores function of transplanted pancreatic islets. Diabetes. 61 (8), 2045-2053 (2012).
- Chen, C., et al. Improved intraportal islet transplantation outcome by systemic IKK-beta inhibition: NF-kappaB activity in pancreatic islets depends on oxygen availability. American Journal of Transplantation. 11 (2), 215-224 (2011).
- Wang, Y., Wang, T., Zhang, L. Three aspects are critical for carrying out intraportal islet transplants successfully in a diabetes mouse model. Experimental and Clinical Transplantation. 10 (3), 302-304 (2012).
- Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination. Journal of Visualized Experiments. (88), e50374 (2014).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).
- Rother, K. I., Harlan, D. M. Challenges facing islet transplantation for the treatment of type 1 diabetes mellitus. Journal of Clinical Investigation. 114 (7), 877-883 (2004).
- Su, Z., et al. Small islets are essential for successful intraportal transplantation in a diabetes mouse model. Scandinavian Journal of Immunology. 72 (6), 504-510 (2010).
- Rekittke, N. E., Ang, M., Rawat, D., Khatri, R., Linn, T. Regenerative Therapy of Type 1 Diabetes Mellitus: From Pancreatic Islet Transplantation to Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells International. 2016, 22 (2016).
