Adéno-associés de livraison induite par le Virus de CRISPR gène cardiaque édition chez la souris
Summary
Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour réaliser en vivo gène cardiaque édition chez la souris à l’aide de Virus recombinant de Adeno-Associated (rAAV)-mediated livraison de CRISPR. Ce protocole propose une stratégie thérapeutique prometteuse pour traiter la cardiomyopathie dystrophique dans la dystrophie musculaire de Duchenne et peut être utilisé pour générer des knockout spécifique cardiaque chez les souris après la naissance.
Abstract
Le système (CRISPR) répéter en cluster, régulièrement dois‑je, court palindrome a grandement facilité le génie du génome dans les cellules cultivées et les organismes vivants d’une grande variété d’espèces. La technologie CRISPR a aussi été utilisée comme thérapeutiques novatrices pour un certain nombre de maladies humaines. Validation des données sont très encourageantes, comme exemplifié par des études récentes qui démontrent la faisabilité et l’efficacité du gène modification thérapeutique approche pour la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) à l’aide d’un modèle murin. En particulier, injection intraveineuse et intrapéritonéale de la rh.74 de sérotype recombinant virus adeno-associé (rAAV) (rAAVrh.74) a permis une prestation cardiaque efficace des Staphylococcus aureus protéine associée à la CRISPR 9 (SaCas9) et deux Guide de RNAs (gRNA) pour supprimer une région génomique avec un codon mutant dans l’exon 23 du gène Dmd de souris. La même approche peut également servir d’assommer le gène d’intérêt et d’étudier leur fonction cardiaque chez les souris après la naissance lorsque le gRNA est conçu pour cibler la région codante du gène. Dans ce protocole, nous montrent en détail comment l’ingénieur vecteur rAAVrh.74-CRISPR et l’accouchement cardiaque très efficace chez les souris néonatales.
Introduction
La cluster, dois‑je régulièrement et brève palindromique répéter (CRISPR) technologie représente la plus récente avancée dans l’ingénierie du génome et a révolutionné la pratique actuelle de la génétique dans les cellules et des organismes. Axée sur les CRISPR génome édition utilise un seul guide RNA (gRNA) pour diriger une endonucléase CRISPR associés tels que les protéines associées aux CRISPR 9 (Cas9) et Cpf1 à une cible d’ADN génomique complémentaire dans l’ordre à le protospacer codée par le gRNA avec un protospacer spécifiques motif adjacent (PAM)1,2. La PAM varie en fonction de l’espèce bactérienne du gène Cas9 ou Cpf1. La nucléase Cas9 plus couramment utilisée, dérivée de Streptococcus pyogenes (SpCas9) reconnaît une séquence de PAM de NGG qui se trouve directement en aval de la séquence cible dans l’ADN génomique, sur le brin non ciblés. Sur le site de la cible, les protéines Cas9 et Cpf1 de générer une interruption de double-brin (DSB), qui est alors réparée via intrinsèques mécanismes de réparation ADN cellulaires y compris la fin non homologue rejoindre (NHEJ) et axés sur l’homologie réparation (HDR) voies3, 4. En l’absence d’une matrice d’ADN de recombinaison homologue, l’ORD est principalement réparé par la voie NHEJ erreurs, ce qui peut entraîner dans les insertions ou les suppressions (indels) des nucléotides, causant des mutations de déphasage si l’ORD ont été créé dans le codage région d’un gène5,6. Ainsi, le système CRISPR a été employé couramment à l’ingénieur mutations perte de fonction différents modèles cellulaires et des organismes entiers, afin d’étudier la fonction d’un gène. En outre, le catalytiquement inactif Cas9 et Cpf1 ont été développés pour transcription et épigénétiquement modulent l’expression des gènes de cible7,8.
Plus récemment, les SpCas9 et les SaCas9 (dérivé de Staphylococcus aureus) ont été emballés dans des vecteurs recombinants virus adeno-associé (rAAV) pour la correction de gène postnatal dans les modèles animaux de maladies humaines, en particulier, de Duchenne musculaire de Duchenne (DMD)9,10,11,12,13,14,15. DMD est une maladie récessive liée à le X mortelle causée par des mutations dans le gène DMD , qui encode la dystrophine protéine16,17, affectant environ un dans 3500 naissances de garçons selon dépistage néonatal18 , 19. il est caractérisé par une faiblesse musculaire progressive et gaspiller. Les patients DMD perdent généralement la capacité de marcher entre 10 et 12 ans et meurent d’insuffisance respiratoire et/ou cardiaque à l’âge de 20-30 ans20. Notamment, la cardiomyopathie se développe à > 90 % des patients DMD et représente la principale cause de décès chez les patients DMD21,22. Bien que déflazacort (un médicament anti-inflammatoire) et Eteplirsen (un exon skipping médecine pour ignorer l’exon 51) ont récemment été approuvés pour DMD par la Food and Drug Administration (FDA)23,24, aucun de ces traitements corriger l’anomalie génétique dans l’ADN génomique. La souris mdx, qui porte une mutation ponctuelle au exon 23 du gène de la dystrophine, a été largement utilisée comme un modèle DMD25. En outre, nous avons démontré précédemment que l’expression de la dystrophine fonctionnelle a été restaurée par la suppression dans le cadre de l’ADN génomique couvrant les exons, 21, 22 et 23 dans les muscles squelettiques des souris mdx à l’aide d’intramusculaire Ad-SpCas9/gRNA livraison9 et dans les muscles du cœur de mdx/utrophine+/- souris à l’aide de livraison de rAAVrh.74-SaCas9/gRNA par voie intraveineuse et intrapéritonéale26.
Dans ce protocole, nous décrivons en détail toutes les étapes dans l’édition de gène cardiaque postnatale pour restaurer la dystrophine dans mdx/utrophine+/- souris à l’aide de vecteurs de rAAVrh.74-SaCas9/gRNA, de gRNA conception à l’analyse de la dystrophine dans les sections de muscle de coeur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce protocole, nous détaillons toutes les étapes nécessaires à la réalisation en vivo gène cardiaque édition chez les souris post-natal utilisant livraison induite par le rAAVrh.74 de SaCas9 et deux gRNAs. Comme mentionné plus haut, cette approche peut être utilisée pour restaurer l’expression de la dystrophine dans les souris dystrophiques tel que décrit dans notre travail27, mais il pourrait aussi permettre des études de génétique inverse rapide des gènes cardiaques…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
R.H. est pris en charge par le U.S. National Institutes of subventions de santé (R01HL116546 et AR064241 R01).
Materials
| Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-21428 | |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | |
| Bio Safety Cabinets | Thermo Fisher Scientific | 1347 | 1300 Series A2 Class II, Type A2 |
| BsaI | New England BioLabs Inc | RO535S | |
| Competent cells | Agilent Technologies | 200314 | |
| Cell culture dishes, 150mm | Nest Scientific USA | 715001 | |
| Cryostat | Leica Biosystems | Leica CM3050S | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | MT10017CV | Corning cellgro |
| Dystrophin antibody | Spring Bioscience | E2660 | |
| Fast-Ion Midi Plasmdi Kits | IBI Scientific | IB47111 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 26-140-079 | |
| Filter Unit, 0.45μm | Thermo Fisher Scientific | 166-0045 | |
| GoTaq Master Mixes | Promega | M7122 | |
| High-speed plasmid mini kit | IBI Scientific | IB47102 | |
| Horse serum | Abcam | ab139501 | |
| Isotemp 2239 Water Bath | Thermo Fisher Scientific | 15-460-11Q | |
| Isotemp Heat Block | Thermo Fisher Scientific | 11-718 | |
| Inverted confocal microscope | Carl Zeiss Microscopy, LLC | LSM 780 | |
| LightCycler 480 instrument | Roche | 5015243001 | LightCycler 480 Instrument II |
| Large Capacity Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 46-910 | Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002445 | Sorvall Legend Micro 21R |
| Nanodrop spectrophotometers | Thermo Scientific | ND2000CLAPTOP | NanoDrop™ 2000/2000c |
| Oligos for i20-F | Integrated DNA Technologies | CACCgGGCGTTGAAATTCTCATTAC | |
| Oligos for i20-R | Integrated DNA Technologies | AAAC GTAATGAGAATTTCAACGCCc; | |
| Oligos for i23-F | Integrated DNA Technologies | CACCgCACCGATGAGAGGGAAAGGTC | |
| Oligos for i23-R | Integrated DNA Technologies | GACCTTTCCCTCTCATCGGTGc | |
| Oligos | Integrated DNA Technologies | ||
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma-Aldrich | D1556-250ML | |
| OptiMEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| PEG8000 | Sigma-Aldrich | 89510-1kg-F | |
| Polyethylenimine | Polysciences | 23966 | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308 | |
| Quick-Seal centrifuge tube | Beckman Coulter Inc | 342414 | |
| QIAquick Gel Extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Radiant SYBR Green Hi-ROX qPCR Kits | Alkali Scientific | QS2005 | |
| RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | K1691 | |
| Rotor | Beckman Coulter Inc | 337922 | Type 70Ti |
| T4 DNA ligase | New England BioLabs Inc | M0202S | |
| Thermal Cycler | Bio-rad | 1861096 | |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc | 8043-30-1192 | Optima le-80k |
| Ultra centrifugal filter unit | MilliporeSigma | UFC510096 | |
| VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories, Inc | H-1200 |
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