Adeno-assoziierten Virus-vermittelte Lieferung von CRISPR für kardiale gen Bearbeitung bei Mäusen
Summary
Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll zur Durchführung kardiale gen bearbeiten in Vivo in Mäusen mit rekombinanten Adeno-Associated Virus (rAAV)-Lieferung von CRISPR vermittelt. Dieses Protokoll bietet eine vielversprechende therapeutische Strategie zur Behandlung von Dystrophischen Kardiomyopathie in Duchenne-Muskeldystrophie und kann verwendet werden, um Herz-Kreislauf-spezifische ko in postnatale Mäuse zu erzeugen.
Abstract
Die gruppierte, regelmäßig dazwischen, kurze, palindromische wiederholende (CRISPR) System hat Genom Engineering in kultivierten Zellen und Organismen aus einer Vielzahl von Arten erheblich erleichtert. Die CRISPR-Technologie ist auch als neuer Therapeutika für eine Reihe von Krankheiten beim Menschen untersucht worden. Proof-of-Concept-Daten sind sehr ermutigend, wie jüngste Studien, die die Machbarkeit und Wirksamkeit von gen bearbeiten-basierte Therapieansatz für Duchenne-Muskeldystrophie (DMD) mit einem Mausmodell zeigen. Intravenöser und intraperitonealer Injektion von recombinant Adeno-assoziierte Virus (rAAV) Serotyp rh.74 (rAAVrh.74) hat vor allem effiziente kardiale Bereitstellung von Staphylococcus Aureus CRISPR-assoziierten Protein 9 (SaCas9) und zwei aktiviert. Guide RNAs (gRNA) um eine genomische Region mit einem mutierten Codon in Exon 23 der Maus Dmd gen zu löschen. Diese Vorgehensweise kann auch verwendet werden, knock out das Gen des Interesses und ihrer Herzfunktion bei postnatalen Mäusen zu studieren, wenn die gRNA der kodierende Region des Gens ansprechen soll. In diesem Protokoll zeigen wir im Detail, wie rAAVrh.74-CRISPR Vektor zu konstruieren und hocheffiziente kardiale Lieferung bei Neugeborenen Mäusen zu erreichen.
Introduction
Die gruppierte, regelmäßig dazwischen, kurze palindromische wiederholende (CRISPR) Technologie stellt die neueste Weiterentwicklung im Genom Engineering und revolutioniert die derzeitige Praxis der Genetik in Zellen und Organismen. CRISPR-basierte Genom-Bearbeitung nutzt einen einzigen Leitfaden RNA (gRNA) eine CRISPR-assoziierten Endonuklease wie CRISPR-assoziierten Protein 9 (Cas9) leiten und Cpf1 zu einem genomische DNA-Ziel, die in Folge der Protospacer ergänzt durch die gRNA mit kodiert ein spezifische Protospacer angrenzenden Motiv (PAM)1,2. PAM ist abhängig von der bakteriellen Spezies des Gens Cas9 oder Cpf1. Die am häufigsten verwendeten Cas9-Nuklease abgeleitet von Streptococcus Pyogenes (SpCas9) erkennt eine PAM-Sequenz von NGG, die direkt hinter der Zielsequenz in der genomischen DNA auf Nichtziel-Strang gefunden wird. An der Ziel-Site generieren die Cas9 und Cpf1 Proteine eine Doppel-Strang-Pause (DSB), die dann über intrinsische zelluläre DNA-Reparaturmechanismen einschließlich nicht-homologe Ende verbinden (NHEJ) und unter der Regie von Homologie Reparatur (HDR) Wege3repariert wird, 4. In Ermangelung einer DNA-Vorlage für homologe Rekombination der DSB in erster Linie Reparaturen durch die fehleranfällige NHEJ Weg, die Einfügungen oder Löschungen (Indels) führen kann von Nukleotiden Frameshift-Mutationen verursacht, wenn die DSB in der Kodierung erstellt wurden Region ein gen5,6. So hat das CRISPR-System verbreitet, Verlust der Funktion Mutationen in verschiedenen zellmodellen und ganze Organismen zu entwickeln um die Funktion eines Gens zu untersuchen. Darüber hinaus die katalytisch inaktive Cas9 und Cpf1 wurden entwickelt, um einen transcriptionally und epigenetisch modulieren Ausdruck Ziel Gene7,8.
In jüngerer Zeit, SpCas9 und SaCas9 (abgeleitet von Staphylococcus Aureus) verpackt in recombinant Adeno-assoziierte Virus (rAAV) Vektoren für postnatale gen Korrektur im Tiermodell von menschlichen Krankheiten, insbesondere Duchenne Muskeldystrophie (DMD)9,10,11,12,13,14,15. DMD ist eine tödliche X-chromosomal rezessiv-Krankheit verursacht durch Mutationen im DMD -gen, das Dystrophin-Protein16,17kodiert, betrifft etwa 1 in 3500 männlichen Geburten nach Neugeborenen-Screening18 , 19. zeichnet sich durch fortschreitende Muskelschwäche und verschwenden. Die DMD-Patienten verlieren in der Regel die Fähigkeit, zwischen 10 und 12 Jahre alt und sterben der Atemwege und/oder kardiale Versagen im Alter von 20-30 Jahre20gehen. Insbesondere entwickelt Kardiomyopathie > 90 % der DMD-Patienten und stellt die führende Ursache des Todes in DMD-Patienten21,22. Obwohl Deflazacort (ein Anti-Entzündung Medikament) und Eteplirsen (ein Exon-skipping Medizin zum Skippen von Exon 51) vor kurzem für DMD durch die Food and Drug Administration (FDA)23,24, keine dieser Behandlungen genehmigt wurden den genetischen Defekt auf der genomischen DNA-Ebene zu korrigieren. Die MDX-Maus, die eine Punktmutation in Exon 23 das Dystrophin-gen trägt, wurde weithin als eine DMD Modell25eingesetzt worden. Darüber hinaus haben wir zuvor gezeigt, dass funktionelle Dystrophin Ausdruck durch-Frame Löschen der genomic DNA für Exons, 21, 22 und 23 in der Skelettmuskulatur Mdx Mäuse mit intramuskulären Ad-SpCas9/gRNA9 wiederhergestellt wurde , und in der Herzmuskulatur Mdx/Utrophin+ /- Mäuse mit intravenöser und intraperitonealer rAAVrh.74-SaCas9/gRNA Lieferung26.
In diesem Protokoll beschreiben wir im Detail jeden Schritt bei der postnatalen kardiale gen Bearbeitung um Dystrophin in Mdx/Utrophin+ /- Mäuse mit rAAVrh.74-SaCas9/gRNA Vektoren von gRNA Design Dystrophin-Analyse in den Herz-Muskel-Abschnitten wiederherzustellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Protokoll zeigen wir die Schritte, die zur Erreichung der in Vivo kardiale gen Bearbeitung in postnatale Mäuse mit rAAVrh.74-vermittelte Lieferung von SaCas9 und zwei gRNAs. Wie bereits erwähnt, dieser Ansatz kann verwendet werden, um Dystrophin Ausdruck in Dystrophischen Mäuse wieder herzustellen, wie in unserer Arbeit27beschrieben, aber es könnte auch schnelle reverse Genetik Studien kardial bedingte Gene in Mäusen ohne den langwierigen Prozess der ermöglichen die tradit…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
R.h. wird vom U.S. National Institutes of Health Zuschüsse (R01HL116546 und R01 AR064241) unterstützt.
Materials
| Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-21428 | |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | |
| Bio Safety Cabinets | Thermo Fisher Scientific | 1347 | 1300 Series A2 Class II, Type A2 |
| BsaI | New England BioLabs Inc | RO535S | |
| Competent cells | Agilent Technologies | 200314 | |
| Cell culture dishes, 150mm | Nest Scientific USA | 715001 | |
| Cryostat | Leica Biosystems | Leica CM3050S | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | MT10017CV | Corning cellgro |
| Dystrophin antibody | Spring Bioscience | E2660 | |
| Fast-Ion Midi Plasmdi Kits | IBI Scientific | IB47111 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 26-140-079 | |
| Filter Unit, 0.45μm | Thermo Fisher Scientific | 166-0045 | |
| GoTaq Master Mixes | Promega | M7122 | |
| High-speed plasmid mini kit | IBI Scientific | IB47102 | |
| Horse serum | Abcam | ab139501 | |
| Isotemp 2239 Water Bath | Thermo Fisher Scientific | 15-460-11Q | |
| Isotemp Heat Block | Thermo Fisher Scientific | 11-718 | |
| Inverted confocal microscope | Carl Zeiss Microscopy, LLC | LSM 780 | |
| LightCycler 480 instrument | Roche | 5015243001 | LightCycler 480 Instrument II |
| Large Capacity Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 46-910 | Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002445 | Sorvall Legend Micro 21R |
| Nanodrop spectrophotometers | Thermo Scientific | ND2000CLAPTOP | NanoDrop™ 2000/2000c |
| Oligos for i20-F | Integrated DNA Technologies | CACCgGGCGTTGAAATTCTCATTAC | |
| Oligos for i20-R | Integrated DNA Technologies | AAAC GTAATGAGAATTTCAACGCCc; | |
| Oligos for i23-F | Integrated DNA Technologies | CACCgCACCGATGAGAGGGAAAGGTC | |
| Oligos for i23-R | Integrated DNA Technologies | GACCTTTCCCTCTCATCGGTGc | |
| Oligos | Integrated DNA Technologies | ||
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma-Aldrich | D1556-250ML | |
| OptiMEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| PEG8000 | Sigma-Aldrich | 89510-1kg-F | |
| Polyethylenimine | Polysciences | 23966 | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308 | |
| Quick-Seal centrifuge tube | Beckman Coulter Inc | 342414 | |
| QIAquick Gel Extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Radiant SYBR Green Hi-ROX qPCR Kits | Alkali Scientific | QS2005 | |
| RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | K1691 | |
| Rotor | Beckman Coulter Inc | 337922 | Type 70Ti |
| T4 DNA ligase | New England BioLabs Inc | M0202S | |
| Thermal Cycler | Bio-rad | 1861096 | |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc | 8043-30-1192 | Optima le-80k |
| Ultra centrifugal filter unit | MilliporeSigma | UFC510096 | |
| VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories, Inc | H-1200 |
References
- Makarova, K. S., Koonin, E. V. Annotation and Classification of CRISPR-Cas Systems. Methods Mol Biol. 1311, 47-75 (2015).
- Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163, 759-771 (2015).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339, 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
- Lieber, M. R. The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway. Annual review of biochemistry. 79, 181-211 (2010).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature protocols. 8, 2281-2308 (2013).
- Zhang, X., Wang, J., Cheng, Q., Zheng, X., Zhao, G. Multiplex gene regulation by CRISPR-ddCpf1. Cell discovery. 3, 17018 (2017).
- Zhang, X. H., Tee, L. Y., Wang, X. G., Huang, Q. S., Yang, S. H. Off-target Effects in CRISPR/Cas9-mediated Genome Engineering. Molecular therapy. Nucleic acids. 4, e264 (2015).
- Xu, L., et al. CRISPR-mediated genome editing restores dystrophin expression and function in mdx mice. Mol Ther. 24, 564-569 (2015).
- Long, C., et al. Postnatal genome editing partially restores dystrophin expression in a mouse model of muscular dystrophy. Science. 351, 400-403 (2016).
- Long, C. Z., et al. Prevention of muscular dystrophy in mice by CRISPR/Cas9-mediated editing of germline DNA. Science. 345, 1184-1188 (2014).
- Nelson, C. E., et al. In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Science. 351, 403-407 (2016).
- Ousterout, D. G. K., Thakore, A. M., Majoros, P. I., Reddy, T. E. W. H., Gersbach, C. A. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause Duchenne muscular dystrophy. Nat Commun. 6, 6244 (2015).
- Tabebordbar, M., et al. In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells. Science. 351, 407-411 (2016).
- Bengtsson, N. E., et al. Muscle-specific CRISPR/Cas9 dystrophin gene editing ameliorates pathophysiology in a mouse model for Duchenne muscular dystrophy. Nat Commun. 8, 14454 (2017).
- Hoffman, E. P., Brown, R. H., Kunkel, L. M. Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus. Cell. 51, 919-928 (1987).
- Nowak, K. J., Davies, K. E. Duchenne muscular dystrophy and dystrophin: pathogenesis and opportunities for treatment. EMBO reports. 5, 872-876 (2004).
- Mendell, J. R., et al. Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy. Annals of neurology. 71, 304-313 (2012).
- Mendell, J. R., Lloyd-Puryear, M. Report of MDA muscle disease symposium on newborn screening for Duchenne muscular dystrophy. Muscle Nerve. 48, 21-26 (2013).
- Spurney, C. F. Cardiomyopathy of Duchenne muscular dystrophy: current understanding and future directions. Muscle Nerve. 44, 8-19 (2011).
- Moriuchi, T., Kagawa, N., Mukoyama, M., Hizawa, K. Autopsy analyses of the muscular dystrophies. Tokushima J Exp Med. 40, 83-93 (1993).
- McNally, E. M. New approaches in the therapy of cardiomyopathy in muscular dystrophy. Annual review of medicine. 58, 75-88 (2007).
- Baker, D. E. Approvals, Submission, and Important Labeling Changes for US Marketed Pharmaceuticals. Hosp Pharm. 52, 306-307 (2013).
- Baker, D. E. Eteplirsen. Hosp Pharm. 52, 302-305 (2017).
- Sicinski, P., et al. The molecular basis of muscular dystrophy in the mdx mouse: a point mutation. Science. 244, 1578-1580 (1989).
- Xu, L., et al. CRISPR-mediated Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Function in mdx Mice. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 24, 564-569 (2016).
- El Refaey, M., et al. In Vivo Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Cardiac Function in Dystrophic Mice. Circ Res. 121, 923-929 (2017).
- Tabebordbar, M., et al. In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells. Science. 351, 407-411 (2016).
- Pozsgai, E. R., Griffin, D. A., Heller, K. N., Mendell, J. R., Rodino-Klapac, L. R. beta-Sarcoglycan gene transfer decreases fibrosis and restores force in LGMD2E mice. Gene therapy. 23, 57-66 (2016).
- Chicoine, L. G., et al. Plasmapheresis eliminates the negative impact of AAV antibodies on microdystrophin gene expression following vascular delivery. Mol Ther. 22, 338-347 (2014).
- Chicoine, L. G., et al. Vascular delivery of rAAVrh74.MCK.GALGT2 to the gastrocnemius muscle of the rhesus macaque stimulates the expression of dystrophin and laminin alpha2 surrogates. Mol Ther. 22, 713-724 (2014).
- Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases. G3. 5, 407-415 (2015).
- Tsai, S. Q., et al. GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases. Nat Biotechnol. 33, 187-197 (2015).
