यहां हम रिकॉमबिनेंट Adeno-एसोसिएटेड वायरस (rAAV) का उपयोग कर चूहों में vivo कार्डियक जीन संपादन में बाहर ले जाने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान CRISPR की मध्यस्थता प्रसव. इस प्रोटोकॉल Duchenne पेशी dystrophy में अपक्षयी cardiomyopathy के इलाज के लिए एक होनहार चिकित्सीय रणनीति प्रदान करता है और जन्मोत्तर चूहों में कार्डियक-विशिष्ट नॉकआउट उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
संकुल, नियमित रूप से अंतराल, लघु, palindromic दोहराने (CRISPR) प्रणाली बहुत प्रजातियों की एक विस्तृत विविधता से दोनों प्रसंस्कृत कोशिकाओं और रहने वाले जीवों में जीनोम इंजीनियरिंग की सुविधा है । CRISPR प्रौद्योगिकी मानव रोगों की एक संख्या के लिए उपंयास चिकित्सकीय के रूप में भी पता लगाया गया है । सबूत की अवधारणा डेटा उच्च हाल के अध्ययनों से उदाहरण के रूप में प्रोत्साहित कर रहे है कि व्यवहार्यता और जीन संपादन की प्रभावकारिता Duchenne पेशी dystrophy (DMD) एक murine मॉडल का उपयोग कर के लिए चिकित्सीय दृष्टिकोण आधारित प्रदर्शन । विशेष रूप से, नसों में और रिकॉमबिनेंट adeno के intraperitoneal इंजेक्शन-जुड़े वायरस (rAAV) सीरोटाइप आरएच 74 (rAAVrh. 74) Staphylococcus aureus CRISPR-जुड़े प्रोटीन 9 (SaCas9) और दो के कुशल कार्डियक डिलीवरी सक्षम है गाइड RNAs (gRNA) माउस एक्सॉन जीन के Dmd 23 में एक उत्परिवर्ती codon के साथ एक जीनोमिक क्षेत्र को नष्ट करने के लिए । यह एक ही दृष्टिकोण भी बाहर का जीन दस्तक के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ब्याज और जन्मोत्तर चूहों में उनके हृदय समारोह का अध्ययन जब gRNA जीन के कोडिंग क्षेत्र को लक्षित करने के लिए डिज़ाइन किया गया है । इस प्रोटोकॉल में, हम विस्तार से दिखाने के लिए कैसे rAAVrh. 74 इंजीनियर को-CRISPR वेक्टर और कैसे नवजात चूहों में अत्यधिक कुशल हृदय वितरण प्राप्त करने के लिए ।
संकुल, नियमित रूप से अंतराल, लघु palindromic दोहराने (CRISPR) प्रौद्योगिकी जीनोम इंजीनियरिंग में सबसे हाल ही में प्रगति का प्रतिनिधित्व करता है और कोशिकाओं और जीवों में आनुवंशिकी के वर्तमान अभ्यास में क्रांति । CRISPR-आधारित जीनोम संपादन एक एकल गाइड आरएनए (gRNA) CRISPR-एसोसिएटेड प्रोटीन 9 (Cas9) और Cpf1 एक जीनोमिक डीएनए लक्ष्य है कि अनुक्रम में protospacer द्वारा इनकोडिंग gRNA के लिए एक के साथ पूरक है के रूप में एक CRISPR-जुड़े endonuclease प्रत्यक्ष करने के लिए इस्तेमाल करता है विशिष्ट protospacer आसंन आकृति (पाम)1,2। पाम Cas9 या Cpf1 जीन की बैक्टीरियल प्रजातियों के आधार पर बदलता है । सबसे अधिक इस्तेमाल किया Cas9 स्ट्रेप्टोकोकस pyogenes (SpCas9) से व्युत्पंन nuclease NGG के एक पाम अनुक्रम है कि सीधे जीनोमिक डीएनए में लक्ष्य अनुक्रम के बहाव, गैर लक्ष्य किनारा पर पाया जाता है पहचानता है । लक्ष्य साइट पर, Cas9 और Cpf1 प्रोटीन एक डबल किनारा तोड़ (DSB) है, जो तो गैर सहित आंतरिक सेलुलर डीएनए मरंमत तंत्र के माध्यम से मरंमत मुताबिक़ अंत में शामिल होने (NHEJ) और समरूपता-निर्देशित मरंमत (HDR) रास्ते3उत्पंन, 4. एक डीएनए मुताबिक़ पुनर्संयोजन के लिए टेंपलेट के अभाव में, DSB मुख्य रूप से त्रुटि प्रवण NHEJ मार्ग है, जो संमिलन या विलोपन में परिणाम कर सकते है द्वारा मरंमत की है (indels) न्यूक्लियोटाइड के कारण frameshift उत्परिवर्तनों अगर DSB कोडिंग में बनाए गए थे एक जीन के क्षेत्र5,6। इस प्रकार, CRISPR प्रणाली व्यापक रूप से किया गया है नुकसान के इंजीनियर के लिए इस्तेमाल समारोह विभिंन सेलुलर मॉडल और पूरे जीवों में उत्परिवर्तनों, क्रम में एक जीन के समारोह की जांच करने के लिए । इसके अलावा, उत्प्रेरक निष्क्रिय Cas9 और Cpf1 transcriptionally और epigenetically लक्ष्य जीन7,8की अभिव्यक्ति मिलाना करने के लिए विकसित किया गया है ।
हाल ही में, दोनों SpCas9 और SaCas9 ( Staphylococcus aureusसे व्युत्पंन) रिकॉमबिनेंट adeno में पैक किया गया है-जुड़े वायरस (rAAV) मानव रोगों के पशु मॉडल में जन्मोत्तर जीन सुधार के लिए वैक्टर, विशेष रूप से, Duchenne दमदार dystrophy (DMD)9,10,11,12,13,14,15. DMD एक घातक एक्स जुड़ा हुआ अवकाश DMD जीन है, जो encodes dystrophin प्रोटीन16,17में उत्परिवर्तनों की वजह से बीमारी है, ३५०० नवजात शिशुओं18 के अनुसार स्क्रीनिंग में लगभग एक को प्रभावित , 19. यह प्रगतिशील मांसपेशियों की कमजोरी और अपव्यय की विशेषता है । DMD रोगियों को आम तौर पर उंर के 10 और 12 साल के बीच चलने की क्षमता खो देते है और 20-30 साल की उंर20से श्वसन और/ विशेष रूप से, cardiomyopathy > DMD रोगियों के 90% में विकसित और DMD रोगियों21,22में मौत का प्रमुख कारण का प्रतिनिधित्व करता है । हालांकि Deflazacort (एक विरोधी सूजन दवा) और Eteplirsen (एक्सॉन ५१ लंघन के लिए एक एक्सॉन लंघन दवा) हाल ही में खाद्य एवं औषधि प्रशासन द्वारा DMD के लिए अनुमोदित किया गया है (एफडीए)23,24, इन उपचार में से कोई भी जीनोमिक डीएनए स्तर पर आनुवंशिक दोष को सही । mdx माउस, जो dystrophin जीन के 23 एक्सॉन में एक बिंदु उत्परिवर्तन किया जाता है, व्यापक रूप से एक DMD मॉडल25के रूप में इस्तेमाल कर दिया गया है । इसके अलावा, हम पहले से प्रदर्शन किया है कि कार्यात्मक dystrophin अभिव्यक्ति में जीनोमिक डीएनए exons 21, 22 और 23 को कवर mdx चूहों के कंकाल की मांसपेशियों में इंट्रामस्क्युलर Ad-SpCas9/gRNA वितरण 9 का उपयोग करके बहाल कर दिया गया था , और mdx/utrophin+/- चूहों का उपयोग नसों में और intraperitoneal rAAVrh. 74-SaCas9/gRNA डिलिवरी26के दिल की मांसपेशियों में ।
इस प्रोटोकॉल में, हम विस्तार से वर्णन में हर कदम जन्मोत्तर कार्डियक जीन संपादन में dystrophin को बहाल करने के लिए mdx/utrophin+/- चूहों का उपयोग rAAVrh. 74-SaCas9/gRNA वैक्टर, gRNA डिजाइन से dystrophin विश्लेषण करने के लिए दिल की मांसपेशी वर्गों में ।
इस प्रोटोकॉल में, हम विस्तार से सभी आवश्यक कदम जन्मोत्तर चूहों में vivo कार्डियक जीन संपादन में प्राप्त करने के लिए rAAVrh का उपयोग कर. 74-SaCas9 और दो gRNAs की मध्यस्थता प्रसव । जैसा कि पहले उल्लेख किया, इस दृष्टिको?…
The authors have nothing to disclose.
R.H. हमें स्वास्थ्य अनुदान (R01HL116546 और R01 AR064241) के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा समर्थित है ।
Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-21428 | |
Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | |
Bio Safety Cabinets | Thermo Fisher Scientific | 1347 | 1300 Series A2 Class II, Type A2 |
BsaI | New England BioLabs Inc | RO535S | |
Competent cells | Agilent Technologies | 200314 | |
Cell culture dishes, 150mm | Nest Scientific USA | 715001 | |
Cryostat | Leica Biosystems | Leica CM3050S | |
DMEM | Thermo Fisher Scientific | MT10017CV | Corning cellgro |
Dystrophin antibody | Spring Bioscience | E2660 | |
Fast-Ion Midi Plasmdi Kits | IBI Scientific | IB47111 | |
FBS | Thermo Fisher Scientific | 26-140-079 | |
Filter Unit, 0.45μm | Thermo Fisher Scientific | 166-0045 | |
GoTaq Master Mixes | Promega | M7122 | |
High-speed plasmid mini kit | IBI Scientific | IB47102 | |
Horse serum | Abcam | ab139501 | |
Isotemp 2239 Water Bath | Thermo Fisher Scientific | 15-460-11Q | |
Isotemp Heat Block | Thermo Fisher Scientific | 11-718 | |
Inverted confocal microscope | Carl Zeiss Microscopy, LLC | LSM 780 | |
LightCycler 480 instrument | Roche | 5015243001 | LightCycler 480 Instrument II |
Large Capacity Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 46-910 | Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus |
Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002445 | Sorvall Legend Micro 21R |
Nanodrop spectrophotometers | Thermo Scientific | ND2000CLAPTOP | NanoDrop™ 2000/2000c |
Oligos for i20-F | Integrated DNA Technologies | CACCgGGCGTTGAAATTCTCATTAC | |
Oligos for i20-R | Integrated DNA Technologies | AAAC GTAATGAGAATTTCAACGCCc; | |
Oligos for i23-F | Integrated DNA Technologies | CACCgCACCGATGAGAGGGAAAGGTC | |
Oligos for i23-R | Integrated DNA Technologies | GACCTTTCCCTCTCATCGGTGc | |
Oligos | Integrated DNA Technologies | ||
OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma-Aldrich | D1556-250ML | |
OptiMEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
PEG8000 | Sigma-Aldrich | 89510-1kg-F | |
Polyethylenimine | Polysciences | 23966 | |
Proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308 | |
Quick-Seal centrifuge tube | Beckman Coulter Inc | 342414 | |
QIAquick Gel Extraction kit | Qiagen | 28704 | |
Radiant SYBR Green Hi-ROX qPCR Kits | Alkali Scientific | QS2005 | |
RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | K1691 | |
Rotor | Beckman Coulter Inc | 337922 | Type 70Ti |
T4 DNA ligase | New England BioLabs Inc | M0202S | |
Thermal Cycler | Bio-rad | 1861096 | |
TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc | 8043-30-1192 | Optima le-80k |
Ultra centrifugal filter unit | MilliporeSigma | UFC510096 | |
VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories, Inc | H-1200 |