Virüs-aracılı teslim CRISPR kardiyak Gene farelerde düzenleme için Adeno ilişkili
Summary
Burada vivo içinde kalp gen rekombinant Adeno-Associated virüs (rAAV) kullanarak farelerde düzenleme taşımak için detaylı bir protokol sağlamak-CRISPR teslimini aracılı. Bu iletişim kuralı distrofik kardiyomiyopati Duchenne kas distrofisi tedavisinde umut verici bir tedavi stratejisi teklifler ve kardiyak özgü nakavt postnatal farelerde oluşturmak için kullanılabilir.
Abstract
Kümelenmiş, düzenli olarak interspaced, kısa, palindromik tekrar (CRISPR) sistemi büyük ölçüde kültürlü hücrelerinde ve canlıların çeşitli türlerin genom mühendislik kolaylaştırdı. CRISPR teknoloji aynı zamanda insan hastalıkların bir dizi roman therapeutics olarak keşfedilmeyi. Kanıtı-of-concept veri tarafından fizibilite ve gen düzenleme tabanlı tedavi yaklaşımı Duchenne kas distrofisi (DMD) bir fare modeli kullanarak için etkinliği gösteren çalışmalar olarak son derece cesaret verici. Özellikle, rekombinant adeno ilişkili virüs (rAAV) serotip rh.74 (rAAVrh.74) intravenöz ve mayi enjeksiyon Staphylococcus aureus CRISPR ilişkili protein 9 verimli bir şekilde kalp teslim (SaCas9) ve iki sağladı exon 23 fare Dmd gen mutasyona uğramış bir kodon ile genomik bir bölgeyi silmek için (gRNA) RNA’ların yol. Bu aynı yaklaşım gen-in-faiz vurmak ve ne zaman gRNA gen Kodlayıcı bölge hedeflemek için tasarlanmıştır kendi kardiyak fonksiyon postnatal farelerde çalışma için kullanılabilir. Bu protokol için rAAVrh.74-CRISPR vektör mühendis ve yüksek verimli kardiyak teslim yenidoğan farelerde elde ayrıntılı olarak gösterir.
Introduction
Kümelenmiş, düzenli olarak interspaced, kısa palindromik tekrar (CRISPR) teknolojisi en son ilerleme genom Mühendisliği temsil eder ve mevcut uygulama hücrelerinde ve organizmaların genetik devrim yarattı. Genom CRISPR tabanlı düzenleme kullanır CRISPR ilişkili bir endonükleaz CRISPR ilişkili protein 9 (Cas9) gibi yönlendirmek için tek bir rehber RNA (gRNA) ve Cpf1 protospacer için sırayla tamamlayıcı bir genomik DNA hedef için kodlanmış ile gRNA tarafından bir belirli protospacer bitişik motifi (PAM)1,2. PAM Cas9 veya Cpf1 geni bakteriyel türler bağlı olarak değişir. Streptococcus pyogenes (SpCas9) elde edilen en sık kullanılan Cas9 nükleaz sigara hedef iplikçikteki genomik DNA doğrudan hedef dizisi aşağı akım bulunur NGG PAM dizisi tanır. Hedef sitede, sonra homolog olmayan sonu (NHEJ) katılma ve Homoloji yönetmen onarım (HDR) yolları3de dahil olmak üzere iç hücresel DNA tamir mekanizmaları tamir iki iplikçikli sonu (DSB), Cas9 ve Cpf1 proteinleri oluşturmak, 4. Homolog rekombinasyon DNA şablon yokluğunda, DSB öncelikle eklemeleri veya silmeleri (indels) ile sonuçlanabilir hataya NHEJ yolu tarafından DSB kodlama oluşturulmuşsa frameshift mutasyonlar neden nükleotit, onarılana bölge bir gen5,6. Böylece, CRISPR sistem yaygın olarak işlev kaybı mutasyonlar çeşitli hücresel modelleri ve tüm organizmalar, mühendis bir gen işlevi araştırmak amacıyla kullanılmaya başlanmıştır. Ayrıca, catalytically etkin olmayan Cas9 ve Cpf1 için transcriptionally geliştirilmiştir ve epigenetically hedef genlerin7,8ifade modüle.
Daha yakın zamanlarda, SpCas9 ve SaCas9 ( Staphylococcus aureustüretilmiş) Doğum sonrası gen düzeltme, insan hastalıkları, hayvan modeli için rekombinant adeno ilişkili virüs (rAAV) vektörel çizimler içine paketlenmiş özellikle, Duchenne kas distrofisi (DMD)9,10,11,12,13,14,15. DMD dystrophin protein16,17-kodlar, DMD gen mutasyonlar neden bir ölümcül X’e bağlı resesif yenidoğan tarama18 göre yaklaşık bir 3500 erkek doğumlular etkileyen bir hastalıktır , 19. progresif kas güçsüzlüğü ve israf ile karakterizedir. DMD hastaları genellikle 10 ile 12 yaş ve solunum ve/veya kalp yetmezliği ölmektedir arasında 20-30 yıl20yaşına yürüyecek yeteneğini kaybetmezsin. En belirgin olarak kardiyomiyopati gelişen > %90 DMD hastaları ve DMD hastaları21,22ölüm önde gelen neden temsil eder. Her ne kadar Deflazacort (anti-inflamasyon ilaç) ve Eteplirsen (bir exon ilacı exon 51 atlama atlama) son zamanlarda DMD için gıda ve İlaç Dairesi (FDA)23,24tarafından bu tedavilerin hiçbiri onaylanmıştır genomik DNA düzeyinde genetik kusur düzeltmek. Bir nokta mutasyon exon 23 dystrophin gen taşır, mdx fare DMD modeli25yaygın olarak kullanmıştır. Ayrıca, biz daha önce fonksiyonel dystrophin ifade çerçeve silme ekzonlar 21, 22 ve 23 Kas içi reklam-SpCas9/gRNA teslim9 kullanarak mdx farelerin iskelet kasları’kapsayan genomik DNA’ın tarafından restore edilerek gösterdi ve intravenöz ve mayi rAAVrh.74-SaCas9/gRNA teslim26kullanarak mdx/utrophin+ /- fareler Kalp kaslarının.
Bu protokol için dystrophin rAAVrh.74-SaCas9/gRNA vektörler, kalp kas bölümlerde dystrophin analiz gRNA tasarım kullanarak mdx/utrophin+ /- farelerde geri yüklemek için Doğum sonrası kardiyak gen düzenleme her adımı biz ayrıntılı olarak tarif.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol için biz vivo içinde kalp gen rAAVrh.74-aracılı teslim SaCas9 ve iki gRNAs kullanma Doğum sonrası farelerde düzenleme elde etmek için gerekli tüm adımları ayrıntılı olarak. Yukarıda belirtildiği, bu yaklaşım bizim iş27‘ açıklandığı gibi dystrophin ifade distrofik farelerde geri yüklemek için kullanılabilir, ancak Ayrıca hızlı ters genetik çalışmalar uzun süreci olmadan farelerde kalp ile ilgili genlerin sağlayabilirsiniz geleneksel nakavt yak…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
R.H. ABD Ulusal Sağlık hibe (R01HL116546 ve R01 AR064241) Enstitüleri tarafından desteklenir.
Materials
| Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-21428 | |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | |
| Bio Safety Cabinets | Thermo Fisher Scientific | 1347 | 1300 Series A2 Class II, Type A2 |
| BsaI | New England BioLabs Inc | RO535S | |
| Competent cells | Agilent Technologies | 200314 | |
| Cell culture dishes, 150mm | Nest Scientific USA | 715001 | |
| Cryostat | Leica Biosystems | Leica CM3050S | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | MT10017CV | Corning cellgro |
| Dystrophin antibody | Spring Bioscience | E2660 | |
| Fast-Ion Midi Plasmdi Kits | IBI Scientific | IB47111 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 26-140-079 | |
| Filter Unit, 0.45μm | Thermo Fisher Scientific | 166-0045 | |
| GoTaq Master Mixes | Promega | M7122 | |
| High-speed plasmid mini kit | IBI Scientific | IB47102 | |
| Horse serum | Abcam | ab139501 | |
| Isotemp 2239 Water Bath | Thermo Fisher Scientific | 15-460-11Q | |
| Isotemp Heat Block | Thermo Fisher Scientific | 11-718 | |
| Inverted confocal microscope | Carl Zeiss Microscopy, LLC | LSM 780 | |
| LightCycler 480 instrument | Roche | 5015243001 | LightCycler 480 Instrument II |
| Large Capacity Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 46-910 | Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002445 | Sorvall Legend Micro 21R |
| Nanodrop spectrophotometers | Thermo Scientific | ND2000CLAPTOP | NanoDrop™ 2000/2000c |
| Oligos for i20-F | Integrated DNA Technologies | CACCgGGCGTTGAAATTCTCATTAC | |
| Oligos for i20-R | Integrated DNA Technologies | AAAC GTAATGAGAATTTCAACGCCc; | |
| Oligos for i23-F | Integrated DNA Technologies | CACCgCACCGATGAGAGGGAAAGGTC | |
| Oligos for i23-R | Integrated DNA Technologies | GACCTTTCCCTCTCATCGGTGc | |
| Oligos | Integrated DNA Technologies | ||
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma-Aldrich | D1556-250ML | |
| OptiMEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| PEG8000 | Sigma-Aldrich | 89510-1kg-F | |
| Polyethylenimine | Polysciences | 23966 | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308 | |
| Quick-Seal centrifuge tube | Beckman Coulter Inc | 342414 | |
| QIAquick Gel Extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Radiant SYBR Green Hi-ROX qPCR Kits | Alkali Scientific | QS2005 | |
| RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | K1691 | |
| Rotor | Beckman Coulter Inc | 337922 | Type 70Ti |
| T4 DNA ligase | New England BioLabs Inc | M0202S | |
| Thermal Cycler | Bio-rad | 1861096 | |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc | 8043-30-1192 | Optima le-80k |
| Ultra centrifugal filter unit | MilliporeSigma | UFC510096 | |
| VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories, Inc | H-1200 |
References
- Makarova, K. S., Koonin, E. V. Annotation and Classification of CRISPR-Cas Systems. Methods Mol Biol. 1311, 47-75 (2015).
- Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163, 759-771 (2015).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339, 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
- Lieber, M. R. The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway. Annual review of biochemistry. 79, 181-211 (2010).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature protocols. 8, 2281-2308 (2013).
- Zhang, X., Wang, J., Cheng, Q., Zheng, X., Zhao, G. Multiplex gene regulation by CRISPR-ddCpf1. Cell discovery. 3, 17018 (2017).
- Zhang, X. H., Tee, L. Y., Wang, X. G., Huang, Q. S., Yang, S. H. Off-target Effects in CRISPR/Cas9-mediated Genome Engineering. Molecular therapy. Nucleic acids. 4, e264 (2015).
- Xu, L., et al. CRISPR-mediated genome editing restores dystrophin expression and function in mdx mice. Mol Ther. 24, 564-569 (2015).
- Long, C., et al. Postnatal genome editing partially restores dystrophin expression in a mouse model of muscular dystrophy. Science. 351, 400-403 (2016).
- Long, C. Z., et al. Prevention of muscular dystrophy in mice by CRISPR/Cas9-mediated editing of germline DNA. Science. 345, 1184-1188 (2014).
- Nelson, C. E., et al. In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Science. 351, 403-407 (2016).
- Ousterout, D. G. K., Thakore, A. M., Majoros, P. I., Reddy, T. E. W. H., Gersbach, C. A. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause Duchenne muscular dystrophy. Nat Commun. 6, 6244 (2015).
- Tabebordbar, M., et al. In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells. Science. 351, 407-411 (2016).
- Bengtsson, N. E., et al. Muscle-specific CRISPR/Cas9 dystrophin gene editing ameliorates pathophysiology in a mouse model for Duchenne muscular dystrophy. Nat Commun. 8, 14454 (2017).
- Hoffman, E. P., Brown, R. H., Kunkel, L. M. Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus. Cell. 51, 919-928 (1987).
- Nowak, K. J., Davies, K. E. Duchenne muscular dystrophy and dystrophin: pathogenesis and opportunities for treatment. EMBO reports. 5, 872-876 (2004).
- Mendell, J. R., et al. Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy. Annals of neurology. 71, 304-313 (2012).
- Mendell, J. R., Lloyd-Puryear, M. Report of MDA muscle disease symposium on newborn screening for Duchenne muscular dystrophy. Muscle Nerve. 48, 21-26 (2013).
- Spurney, C. F. Cardiomyopathy of Duchenne muscular dystrophy: current understanding and future directions. Muscle Nerve. 44, 8-19 (2011).
- Moriuchi, T., Kagawa, N., Mukoyama, M., Hizawa, K. Autopsy analyses of the muscular dystrophies. Tokushima J Exp Med. 40, 83-93 (1993).
- McNally, E. M. New approaches in the therapy of cardiomyopathy in muscular dystrophy. Annual review of medicine. 58, 75-88 (2007).
- Baker, D. E. Approvals, Submission, and Important Labeling Changes for US Marketed Pharmaceuticals. Hosp Pharm. 52, 306-307 (2013).
- Baker, D. E. Eteplirsen. Hosp Pharm. 52, 302-305 (2017).
- Sicinski, P., et al. The molecular basis of muscular dystrophy in the mdx mouse: a point mutation. Science. 244, 1578-1580 (1989).
- Xu, L., et al. CRISPR-mediated Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Function in mdx Mice. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 24, 564-569 (2016).
- El Refaey, M., et al. In Vivo Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Cardiac Function in Dystrophic Mice. Circ Res. 121, 923-929 (2017).
- Tabebordbar, M., et al. In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells. Science. 351, 407-411 (2016).
- Pozsgai, E. R., Griffin, D. A., Heller, K. N., Mendell, J. R., Rodino-Klapac, L. R. beta-Sarcoglycan gene transfer decreases fibrosis and restores force in LGMD2E mice. Gene therapy. 23, 57-66 (2016).
- Chicoine, L. G., et al. Plasmapheresis eliminates the negative impact of AAV antibodies on microdystrophin gene expression following vascular delivery. Mol Ther. 22, 338-347 (2014).
- Chicoine, L. G., et al. Vascular delivery of rAAVrh74.MCK.GALGT2 to the gastrocnemius muscle of the rhesus macaque stimulates the expression of dystrophin and laminin alpha2 surrogates. Mol Ther. 22, 713-724 (2014).
- Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases. G3. 5, 407-415 (2015).
- Tsai, S. Q., et al. GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases. Nat Biotechnol. 33, 187-197 (2015).
