JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
유전학

At udforske Root Microbiome: udtrække bakteriel Fællesskabets Data fra jord, rhizosfære og rod Endosphere

Published: May 02, 2018
doi:
10.3791/57561
, , ,
1Department of Plant and Microbial Biology,University of California, Berkeley, 2Plant Gene Expression Center,USDA ARS

Summary

Her, beskriver vi en protokol for at opnå amplikon sekvens data af jord, rhizosfære og roden endosphere microbiomes. Denne information kan bruges til at undersøge sammensætningen og mangfoldighed af plante-forbundet mikrobielle samfund, og er velegnet til brug med en bred vifte af plantearter.

Abstract

Det intime samspil mellem plante vært og tilknyttede mikroorganismer er afgørende betydning for anlægget fitness, og kan fremme forbedrede tolerance over for abiotisk understreger og sygdomme. Som plante microbiome kan være meget komplekse, lave omkostninger, er høj overførselshastighed metoder såsom amplikon-baserede sekventering af 16S rRNA-genet ofte at foretrække for kendetegner dets mikrobielle sammensætning og mangfoldighed. Udvælgelse af passende metode når gennemføre sådanne eksperimenter er imidlertid afgørende for at mindske skævheder, der kan vanskeliggøre analyse og sammenligninger mellem prøver og undersøgelser. Denne protokol beskriver i detaljer en standardiseret metode til indsamling og udvinding af DNA fra jord, rhizosfære og rod prøver. Derudover vi fremhæve en veletableret 16S rRNA-amplikon sekventering rørledning, der giver mulighed for udforskning af sammensætningen af bakterielle samfund i disse prøver, og kan nemt tilpasses til andre markørgener. Denne rørledning er blevet valideret for en række plantearter, herunder sorghum, majs, hvede, jordbær og agave, og kan hjælpe med at overvinde problemer forbundet med forurening fra anlægget organeller.

Introduction

Plante-forbundet microbiomes består af dynamiske og komplekse mikrobielle samfund består af bakterier, archaea, vira, svampe og andre mikroorganismer i eukaryote. Ud over deres velundersøgte rolle i forårsager plantesygdomme, kan plante-forbundet mikrober også positivt påvirke plantesundhed ved at forbedre tolerance over for biotisk og abiotisk understreger, at fremme næringsstoftilgængelighed og forbedring af planternes vækst gennem produktion af Phytohormoner. Af denne grund findes særlig interesse i kendetegner de taxa, som forbinder med anlægget rod endospheres, rhizospheres og den omgivende jord. Mens nogle mikrober kan være kulturperler i isolation på laboratoriet genererede medier, mange ikke, dels fordi de kan stole på symbiotiske relationer med andre mikrober, vokser meget langsomt, eller kræver betingelser, der ikke kan genskabes i et laboratoriemiljø. Fordi det omgår behovet for dyrkning og er relativt billig og høj overførselshastighed, er sekvens-baserede fylogenetiske profilering af miljømæssige og vært-associerede mikrobielle prøver blevet en foretrukne metode til paavisning mikrobielle samfund sammensætning.

Udvælgelse af passende sekventering teknologier fra forskellige næste generation sequencing (NGS) platforme1 er afhængig af brugernes behov, med vigtige faktorer herunder: ønskede dækning, amplikon længde, forventes EF mangfoldighed, samt sekventering fejlprocenten, læse-længde og cost-per-run/megabase. En anden variabel, der skal overvejes i amplikon-baserede sekventering eksperimenter er hvad gen vil blive forstærket og hvad primere vil blive brugt. Når designe eller vælge primere, er forskere ofte tvunget til at indgå kompromiser mellem universelle forstærkning af og den taksonomiske opløsning opnåelige fra den resulterende amplikoner. Derfor valgte disse typer af undersøgelser ofte primere og markører, der selektivt målrette specifikke delmængder af microbiome. Evaluering af sammensætningen af bakterielle samfund er almindeligt opnås ved sekventering en eller flere af hypervariable regionerne af bakteriel 16S rRNA gen2,3. I denne undersøgelse, vi beskriver en amplikon baseret sekventering protokol udviklet til en NGS platform mål 500 bp V3-V4 regionen af bakteriel 16S rRNA gen, som giver mulighed for bred forstærkning af bakteriel taxa samtidig også give tilstrækkelig variation til skelne mellem forskellige taxa. Derudover kan denne protokol nemt tilpasses til brug med andre primer sæt, såsom rettet mod ITS2 markøren af svampe eller 18S rRNA underenhed af eukaryoter.

Mens andre tilgange såsom shotgun metagenomics, metatranscriptomics og encellede sekventering, tilbyder andre fordele, herunder løst mikrobielle genomer og mere direkte måling af Fællesskabets funktion, er disse teknikker typisk mere dyrt og beregningskrævende end den fylogenetiske profilering beskrevet her4. Derudover udfører shotgun metagenomics og metatranscriptomics på rod prøver giver en stor procentdel af læser tilhører værten plante genom, og metoder til at overvinde denne begrænsning er stadig at blive udviklet5,6.

Som med enhver eksperimentelle platform, kan amplikon-baserede profilering indføre en række potentielle afvigelser, som bør overvejes under den eksperimentelle design og data analyse. Disse omfatter metoder til prøvetagning, DNA udvinding, udvalg af PCR-primere, og hvordan bibliotek forberedelse udføres. Forskellige metoder kan markant indflydelse på mængden af brugbare data genereret, og kan også hæmme bestræbelserne på at sammenligne resultater mellem undersøgelser. For eksempel, metoden til at fjerne rhizosfære bakterier7 og brugen af forskellige udvinding teknikker eller valg af DNA udvinding kits8,9 har vist sig at betydeligt påvirke downstream analyse, hvilket fører til forskellige konklusioner vedrørende som mikrober er nutid og deres relative mængder. Da amplikon-baserede profilanalyse kan være tilpasset, kan foretage sammenligninger på tværs af undersøgelser være udfordrende. Jorden Microbiome projekt har foreslået, at forskere studerer komplekse systemer som plante-forbundet microbiome ville drage fordel af udviklingen af standardiserede protokoller som et middel til minimering af variation forårsaget af anvendelsen af forskellige metoder mellem undersøgelser10,11. Her vi diskutere mange af de ovennævnte emner, og tilbud forslag til bedste praksis, hvor det er relevant.

Protokollen viser processen med at indsamle jord, rhizosfære og rod prøver fra Sorghum bicolor og uddrager DNA ved hjælp af en veletableret DNA isolering kit11. Vores protokol indeholder desuden en detaljeret amplikon sekventering arbejdsproces, ved hjælp af et almindeligt udnyttede NGS platform, for at bestemme strukturen af den bakterielle samfund12,13,14. Denne protokol er blevet valideret til brug i en bred vifte af plante værter i en nylig offentliggjort undersøgelse af rødder, rhizosfære og tilknyttede jord af 18 monocot arter herunder Sorghum bicolor, Zea mays, og Triticum aestivum15. Denne metode er også blevet valideret til brug sammen med andre markørgener, som det fremgår af dens vellykkede program til at studere de svampe ITS2 markørgen i undersøgelser af agave microbiome16,17 og jordbær microbiome 18.

Protocol

1. samling og adskillelse af rod Endosphere, rhizosfære og jordprøver Forudgående at ind i feltet, autoklave ultrarent vand (mindst 90 mL vand pr. prøve) at sterilisere. Forberede epifyt fjernelse buffer (mindst 25 mL pr. sample) ved at tilføje 6,75 g KH2PO4, 8,75 g K2HPO4og 1 mL Triton X-100, 1 L af sterilt vand. Sterilisere bufferen ved hjælp af et vakuum filter med 0,2 µm porestørrelse. Til trin 1,2 til 1,5, slid rene handsker steriliseret med ethan…

Representative Results

Udfører de anbefalede protokollen bør resultere i et datasæt af indekserede parret ende læser, der kan matches tilbage til hver prøve og tildelt enten en bakteriel operationelle taksonomiske enheder (OTU) eller nøjagtige rækkefølge variant (ESV, også benævnt amplikon sekvens variant (ASV) og sub-operational taksonomisk enhed (sOTU)), afhængigt af downstream analyse. For at opnå høj kvalitet sekvens data, skal der udvises forsigtighed på hvert trin at bevare sammenhængen mel…

Discussion

Denne protokol viser en etableret rørledningen for at udforske rod endosphere, rhizosfære og jord mikrobielle samfund kompositioner, fra feltet prøveudtagning til prøve behandling og downstream sekventering. Studere root-associerede microbiomes præsenterer unikke udfordringer, skyldes dels de iboende vanskeligheder i prøvetagning fra jord. Jord er meget variabel i form af fysiske og kemiske egenskaber og forskellige jordbundsforhold kan være adskilt af så lidt som et par millimeter28,…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev finansieret af USDA-ARS (CRIS 2030-21430-008-00D). TS understøttes af NSF Graduate Research Fellowship Program.

Materials

0.1-10/20 µL filtered micropipette tips USA Scientific 1120-3810 Can substitute with equivalent from other suppliers.
1.5 mL microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5510 Can substitute with equivalent from other suppliers.
10 µL multi-channel pipette Eppendorf 3122000027 Can substitute with equivalent from other suppliers.
10 µL, 100 µL, and 1000 µL micropipettes Eppendorf 3120000909 Can substitute with equivalent from other suppliers.
100 µL multi-channel pipette Eppendorf 3122000043 Can substitute with equivalent from other suppliers.
1000 µL filtered micropipette tips USA Scientific 1122-1830 Can substitute with equivalent from other suppliers.
2 mL microcentrifuge tubes USA Scientific 1620-2700 Can substitute with equivalent from other suppliers.
2 mm soil sieve Forestry Suppliers 60141009 Can substitute with equivalent from other suppliers.
200 µL filtered micropipette tips USA Scientific 1120-8810 Can substitute with equivalent from other suppliers.
25 mL reservoirs VWR International LLC 89094-664 Can substitute with equivalent from other suppliers.
50 mL conical vials Thermo Fisher Scientific 352098 Can substitute with equivalent from other suppliers.
500 mL vacuum filters (0.2 µm pore size) VWR International LLC 156-4020
96-well microplates USA Scientific 655900
96-well PCR plates BioRad HSP9631
Agencourt AMPure XP beads Thermo Fisher Scientific NC9933872 Instructions for use:
https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/ajax/downloadDocument/B37419AA.pdf?autonomyId=TP_DOC_150180&documentName=B37419AA.pdf
Aluminum foil Boardwalk 7124 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Analytical scale with 0.001 g resolution Ohaus Pioneer PA323 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Bioruptor Plus ultrasonicator Diagenode B01020001
Bovine Serum Albumin (BSA) 20 mg/mL New England Biolabs B9000S
Centrifuge Eppendorf 5811000908 Including 50mL and 96-well plate bucket adapters
Cryogenic gloves Millipore Sigma Z183490 Can substitute with equivalent from other suppliers.
DNeasy PowerClean kit (optional) Qiagen Inc. 12877-50 Previously MoBio
DNeasy PowerSoil kit Qiagen Inc. 12888-100 Previously MoBio
Dry ice Any NA
DynaMag-2 magnet Thermo Fisher Scientific 12321D Do not substitute
Ethanol VWR International LLC 89125-188 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Gallon size freezer bags Ziploc NA Can substitute with equivalent from other suppliers.
Gemini EM Microplate Reader Molecular Devices EM Can use another fluorometer that reads 96-well plates from the top.
K2HPO4 Sigma-Aldrich P3786
KH2PO4 Sigma-Aldrich P5655
Lab coat Workrite J1367 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Liquid N2 Any NA Can substitute with equivalent from other suppliers.
Liquid N2 dewar Thermo Fisher Scientific 4150-9000 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Milli-Q ultrapure water purification system Millipore Sigma SYNS0R0WW
Mini-centrifuge Eppendorf 5404000014
Molecular grade water Thermo Fisher Scientific 4387937 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Mortars VWR International LLC 89038-150 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Nitrile gloves Thermo Fisher Scientific 19167032B Can substitute with equivalent from other suppliers.
Paper towels VWR International LLC BWK6212 Can substitute with equivalent from other suppliers.
PCR plate sealing film Thermo Fisher Scientific NC9684493
PCR strip tubes USA Scientific 1402-2700
Pestles VWR International LLC 89038-166 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Plastic spatulas LevGo, Inc. 17211
Platinum Hot Start PCR Master Mix (2x) Thermo Fisher Scientific 13000014
PNAs – chloroplast and mitochondrial PNA Bio NA Make sure to verify sequence bioinformatically
Protective eyewear Millipore Sigma Z759015 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Qubit 3.0 Fluorometer Thermo Fisher Scientific Q33216
Qubit dsDNA HS assay kit Thermo Fisher Scientific Q32854
Rubber mallet (optional) Ace Hardware 2258622 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Shears or scissors VWR International LLC 89259-936 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Shovel Home Depot 2597400 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Soil core collector (small diameter: <1 inch) Ben Meadows 221700 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Spray bottles Santa Cruz Biotechnology sc-395278 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Standard desalted barcoded primers (10 µM) (Table 1) IDT NA 4 nmole Ultramer DNA Oligo with standard desalting. NGS adapter and sequencing primer (Table 1) are designed for use with Illumina MiSeq using v3 chemistry.
Thermocycler Thermo Fisher Scientific E950040015 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Weigh boats Spectrum Chemicals B6001W Can substitute with equivalent from other suppliers.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nat Rev Genet. 17 (6), 333-351 (2016).
  2. Soergel, D. A. W., Dey, N., Knight, R., Brenner, S. E. Selection of primers for optimal taxonomic classification of environmental 16S rRNA gene sequences. ISME J. 6 (7), 1440-1444 (2012).
  3. Takahashi, S., Tomita, J., Nishioka, K., Hisada, T., Nishijima, M. Development of a Prokaryotic Universal Primer for Simultaneous Analysis of Bacteria and Archaea Using Next-Generation Sequencing. PLoS One. 9 (8), e105592 (2014).
  4. Poretsky, R., Rodriguez-R, L. M., Luo, C., Tsementzi, D., Konstantinidis, K. T. Strengths and Limitations of 16S rRNA Gene Amplicon Sequencing in Revealing Temporal Microbial Community Dynamics. PLoS One. 9 (4), e93827 (2014).
  5. Sharpton, T. J. An introduction to the analysis of shotgun metagenomic data. Front Plant Sci. 5, 209 (2014).
  6. Jiao, J. -. Y., Wang, H. -. X., Zeng, Y., Shen, Y. -. M. Enrichment for microbes living in association with plant tissues. J Appl Microbiol. 100 (4), 830-837 (2006).
  7. Richter-Heitmann, T., Eickhorst, T., Knauth, S., Friedrich, M. W., Schmidt, H. Evaluation of Strategies to Separate Root-Associated Microbial Communities: A Crucial Choice in Rhizobiome Research. Front Microbiol. 7, 773 (2016).
  8. Mahmoudi, N., Slater, G. F., Fulthorpe, R. R., Mahmoudi, N., Slater, G. F., Fulthorpe, R. R. Comparison of commercial DNA extraction kits for isolation and purification of bacterial and eukaryotic DNA from PAH-contaminated soils. Can J Microbiol. 5709, 623-628 (2011).
  9. Vishnivetskaya, T. A., et al. Commercial DNA extraction kits impact observed microbial community composition in permafrost samples. FEMS Microbiol Ecol. 87 (1), 217-230 (2014).
  10. Busby, P. E., et al. Research priorities for harnessing plant microbiomes in sustainable agriculture. PLoS Biol. 15 (3), e2001793 (2017).
  11. Thompson, L. R., et al. A communal catalogue reveals Earth’s multiscale microbial diversity. Nature. , (2017).
  12. Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME J. 6 (8), 1621-1624 (2012).
  13. Kozich, J. J., Westcott, S. L., Baxter, N. T., Highlander, S. K., Schloss, P. D. Development of a Dual-Index Sequencing Strategy and Curation Pipeline for Analyzing Amplicon Sequence Data on the MiSeq Illumina Sequencing Platform. Appl Environ Microb. 79 (17), 5112-5120 (2013).
  14. Degnan, P. H., Ochman, H. Illumina-based analysis of microbial community diversity. ISME J. 6 (1), 183-194 (2012).
  15. Naylor, D., DeGraaf, S., Purdom, E., Coleman-Derr, D. Drought and host selection influence bacterial community dynamics in the grass root microbiome. ISME J. , (2017).
  16. Desgarennes, D., Garrido, E., Torres-Gomez, M. J., Peña-Cabriales, J. J., Partida-Martinez, L. P. Diazotrophic potential among bacterial communities associated with wild and cultivated Agave species. FEMS Microbiol Ecol. 90 (3), 844-857 (2014).
  17. Coleman-Derr, D., et al. Plant compartment and biogeography affect microbiome composition in cultivated and native Agave species. New Phytol. 209 (2), 798-811 (2016).
  18. De Tender, C., et al. Dynamics in the Strawberry Rhizosphere Microbiome in Response to Biochar and Botrytis cinerea Leaf Infection. Front Microbiol. 7, 2062 (2016).
  19. Kapp, J. R., et al. Variation in pre-PCR processing of FFPE samples leads to discrepancies in BRAF and EGFR mutation detection: a diagnostic RING trial. J Clin Pathol. 68 (2), 111-118 (2015).
  20. Simbolo, M., et al. DNA qualification workflow for next generation sequencing of histopathological samples. PLoS One. 8 (6), e62692 (2013).
  21. O’Neill, M., McPartlin, J., Arthure, K., Riedel, S., McMillan, N. Comparison of the TLDA with the Nanodrop and the reference Qubit system. J Phys Conf Ser. 307 (1), 012047 (2011).
  22. Callahan, B. J., McMurdie, P. J., Rosen, M. J., Han, A. W., Johnson, A. J. A., Holmes, S. P. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nat Methods. 13 (7), 581-583 (2016).
  23. Amir, A., et al. Deblur Rapidly Resolves Single-Nucleotide Community Sequence Patterns. mSystems. 2 (2), e00191-e00116 (2017).
  24. Edgar, R. C. UNOISE2: improved error-correction for Illumina 16S and ITS amplicon sequencing. bioRxiv. , 081257 (2016).
  25. Nguyen, N. -. P., Warnow, T., Pop, M., White, B. A perspective on 16S rRNA operational taxonomic unit clustering using sequence similarity. NPJ Biofilms Microbiomes. 2, 16004 (2016).
  26. Callahan, B. J., McMurdie, P. J., Holmes, S. P. Exact sequence variants should replace operational taxonomic units in marker-gene data analysis. ISME J. , (2017).
  27. Lundberg, D. S., Yourstone, S., Mieczkowski, P., Jones, C. D., Dangl, J. L. Practical innovations for high-throughput amplicon sequencing. Nat Methods. 10 (10), 999-1002 (2013).
  28. O’Brien, S. L., et al. Spatial scale drives patterns in soil bacterial diversity. Environ Microbiol. 18 (6), 2039-2051 (2016).
  29. Fierer, N., Lennon, J. T. The generation and maintenance of diversity in microbial communities. Am J Bot. 98 (3), 439-448 (2011).
  30. Fierer, N. Embracing the unknown: disentangling the complexities of the soil microbiome. Nat Rev Microbiol. 15 (10), 579-590 (2017).
  31. Buckley, D. H., Schmidt, T. M. Diversity and dynamics of microbial communities in soils from agro-ecosystems. Environ Microbiol. 5 (6), 441-452 (2003).
  32. Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biol. 12, 87 (2014).
  33. Weiss, S., Amir, A., Hyde, E. R., Metcalf, J. L., Song, S. J., Knight, R. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biol. 15 (12), 564 (2014).
  34. Sutlović, D., Definis Gojanović, M., Andelinović, S., Gugić, D., Primorac, D. Taq polymerase reverses inhibition of quantitative real time polymerase chain reaction by humic acid. Croat Med J. 46 (4), 556-562 (2005).
  35. Sutlovic, D., Gamulin, S., Definis-Gojanovic, M., Gugic, D., Andjelinovic, S. Interaction of humic acids with human DNA: proposed mechanisms and kinetics. Electrophoresis. 29 (7), 1467-1472 (2008).
  36. Aleklett, K., Leff, J. W., Fierer, N., Hart, M. Wild plant species growing closely connected in a subalpine meadow host distinct root-associated bacterial communities. PeerJ. 3, e804 (2015).
  37. Bogas, A. C., et al. Endophytic bacterial diversity in the phyllosphere of Amazon Paullinia cupana associated with asymptomatic and symptomatic anthracnose. Springerplus. 4, 258 (2015).
  38. Hiscox, J., Savoury, M., Müller, C. T., Lindahl, B. D., Rogers, H. J., Boddy, L. Priority effects during fungal community establishment in beech wood. ISME J. 9 (10), 2246-2260 (2015).
  39. Zhang, T., Yao, Y. -. F. Endophytic Fungal Communities Associated with Vascular Plants in the High Arctic Zone Are Highly Diverse and Host-Plant Specific. PLoS One. 10 (6), e0130051 (2015).
  40. Ghyselinck, J., Pfeiffer, S., Heylen, K., Sessitsch, A., De Vos, P. The effect of primer choice and short read sequences on the outcome of 16S rRNA gene based diversity studies. PLoS One. 8 (8), e71360 (2013).
  41. Wintzingerode, F., Landt, O., Ehrlich, A., Göbel, U. B. Peptide nucleic acid-mediated PCR clamping as a useful supplement in the determination of microbial diversity. Appl Environ Microb. 66 (2), 549-557 (2000).
  42. Cruaud, P., Vigneron, A., Lucchetti-Miganeh, C., Ciron, P. E., Godfroy, A., Cambon-Bonavita, M. -. A. Influence of DNA extraction method, 16S rRNA targeted hypervariable regions, and sample origin on microbial diversity detected by 454 pyrosequencing in marine chemosynthetic ecosystems. Appl Environ Microb. 80 (15), 4626-4639 (2014).
  43. Yang, B., Wang, Y., Qian, P. -. Y. Sensitivity and correlation of hypervariable regions in 16S rRNA genes in phylogenetic analysis. BMC Bioinformatics. 17, 135 (2016).

Tags

Root MicrobiomeSoilRhizosphereRoot Endosphere16S Ribosomal RNA GeneCommunity ProfilingMicrobial EcologyDNA ExtractionSequencing LibrarySoil CoreRhizosphere SeparationRoot WashingDNA Extraction
check_url/kr/57561?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Simmons, T., Caddell, D. F., Deng, S., Coleman-Derr, D. Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere. J. Vis. Exp. (135), e57561, doi:10.3791/57561 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image