Her beskriver vi metoder ved hjælp af spinning disk Konfokal mikroskopi billede enkelt fagocyterende arrangementer af mus bosiddende peritoneal makrofager. Protokollerne kan udvides til at omfatte andre fagocyterende celler.
Fagocytose spiller en nøglerolle i vært forsvar, samt væv udvikling og vedligeholdelse, og indebærer hurtige, receptor-medieret rearrangementer af actin cytoskelettet til fange, indhylle og opsluge store partikler. Selv om fagocyterende receptorer, downstream signaling veje og effektorer, såsom Rho GTPases, er blevet identificeret, den dynamiske cytoskeletal remodellering af specifikke receptor-medieret fagocyterende begivenheder er uklare. Fire årtier siden, to forskellige mekanismer af fagocytose, eksemplificeret ved Fcγ receptor (FcγR)- og supplere receptor (CR) – medieret fagocytose, blev identificeret ved hjælp af scanning Elektron Mikroskopi. Binding af immunoglobulin G (IgG)-opsonized partikler til FcγRs udløser fremspring i tynd membran extensions, som først danner en såkaldt fagocyterende cup omkring partiklen før det bliver helt lukket og trukket ind i cellen. Derimod synes supplerer opsonized partikler at synke ned i den phagocyt efter bindende at supplere receptorer. Disse to tilstande af fagocytose, fagocyterende cup dannelse og synker i, er blevet veletableret i litteraturen. Imidlertid har forskellene mellem de to tilstande udviskes af rapporter at supplere receptor-medieret fagocytose kan fremkalde forskellige membran fremspring. Med tilgængeligheden af høj opløsning imaging teknikker, fagocytose assays er påkrævet at tillade real-time 3D (tre-dimensionelle) visualisering af hvordan specifikke fagocyterende receptorer mægle optagelsen af enkelte partikler. Mere anvendt almindeligt tilgange til studiet af fagocytose, som end-point assays, glip af muligheden for at forstå hvad der sker på grænsefladen af partikler og fagocytter. Her beskriver vi fagocyterende assays, bruge time-lapse spinning disk Konfokal mikroskopi, der giver mulighed for 3D imaging af enkelt fagocyterende begivenheder. Derudover beskriver vi assays utvetydigt billede Fcγ receptor – eller supplere receptor-medieret fagocytose.
Tyve år før Metchnikoff’s observation af fagocyterende udkom celler i søstjerner larver, i 1882, og efterfølgende udvikling af sin teori om fagocytose1, beskrevet Ernest Haeckel, i 1862, engulfment af uopløselige farvestof partikler af blod celler af Thetis fimbris (Tethys fimbria), en art af aggressiv havet skovsnegl (Ernest Haeckel. Die Radiolarien (Rhizopoda radiaria): Eine Monographie; Druck und Verlag von Georg Reimer, Berlin, 1862). Han beskrevet udtrykkeligt membran fremspring omsluttende partikler, som efterfølgende blev taget i cytoplasmaet og akkumuleret omkring cellekernen. Mere end 100 år senere, foreslog en banebrydende undersøgelse af Kaplan, at der var mindst to morfologisk forskellige mekanismer af fagocytose2. Kaplan viste ved scanning elektronmikroskopi at peritoneal musen makrofager indtages en IgG-opsonized får røde blodlegemer ved hjælp af tynd membran extensions, som nåede op og tæt indhyllet partiklen, i første omgang gav anledning til en kop-lignende struktur. Fagocyterende cup dannelse kræves actin polymerisering, da det blev ophævet af celle-gennemtrængelige svampe toksin cytochalasin B, kendt for at blokere actin dynamics3. Derimod syntes får røde blodlegemer opsonized med supplement at synke direkte i makrofag uden generations membranen udvidelser, selvom i nogle billeder, membran flæser kan ses i den umiddelbare nærheden af de synkende partikler. I modsætning til fagocyterende cup dannelse var supplere receptor-medieret synker insenstive til cytochalasin B behandling2. I eksperimenter beskrevet af Kaplan, supplement hjælp blev udført ved at inkubere immunoglobulin M (IgM) mærket får røde blodlegemer med serum fra supplement C5-mangelfuld mus, der omgår hæmolyse af supplement C5-afhængige terminal supplere komplekse.
De to tilstande af fagocytose, fagocyterende cup dannelse og synker i, identificeret ved Kaplan er blevet etableret udtalelse i felt4,5,6,7,8,9 . Men ultra-høj opløsning billeder brugt i den oprindelige undersøgelse af Kaplan2, samt en lignende undersøgelse af Munthe-Kaas et al. 10, kun give snapshots af fagocyterende begivenheder. I en nylig gennemgang, Rougerie et al. 11 understregede at morfologiske forskelle mellem FcγR – og CR-medieret fagocytose forblive at være afklaret, og derudover membran flæser er blevet observeret under supplere receptor-medieret partikel optagelse2. Live-celle billeddannelse af enkelt fagocyterende arrangementer der strækker sig fra partikel capture til internalisering, kombineret med genetisk modificerede musemodeller, kunne i høj grad forbedre vores forståelse af hvordan fagocytter fange og indtage partikler. En metode kunne være at bruge hurtigt atomic force mikroskopi (AFM) som giver ultra-høj opløsning (10-20 nm) topografiske billeddannelse af levende celler. For nylig er blevet udviklet en hurtig AFM system12 , som er egnet til billedbehandling celle overflader hurtigt med lav støj. Denne teknik har fordelen, at høj opløsning, topografiske og mekaniske parametre af levende celler kan måles med korte intervaller (sekunder), i modsætning til scanning elektronmikroskopi, hvilket nødvendiggør fiksering og kritiske punkt tørring af celler. En anden fremgangsmåde er time-lapse 3D Konfokal mikroskopi, som er alment tilgængelige, selvom fototoksicitet og blegning er begrænsende faktorer under optagelser. Denne tilgang er meget alsidigt og giver optisk skæring med stor rumlig opløsning og giver mulighed for ekstraordinære fleksibilitet i mærkning med en svimlende udvalg af fluorescerende sonder, herunder genetisk kodet fluorescerende proteiner. Her beskriver vi fagocytose assays bruge time-lapse spinning disk Konfokal mikroskopi, der giver mulighed for høj spatiotemporelle opløsning af bestemt receptor-medieret fagocyterende begivenheder.
Langt størstedelen af fagocytose assays, især end-point og høj overførselshastighed assays, giver ikke visualisering af hvordan partikler faktisk fanget, indhyllede og indtages. Banebrydende undersøgelser af Munthe-Kaas et al. 10 og Kaplan2 i 1970 ‘ erne foreslog at påfaldende forskellige cytoskeletal reorganisering blev involveret i fagocytose af IgG-opsonized kontra komplement-opsonized partikler (får røde blodlegemer). Her beskriver vi fagocytose assays ved hjælp af spinning disk Konfokal mikroskopi, som giver mulighed for høj opløsning, real-time imaging af enkelt fagocyterende begivenheder. Vores model phagocyt er den mus bosiddende peritoneal makrofager, der kan isoleres med minimal håndtering, og vi bruger frisk isolerede humane røde blodlegemer som partikler. Dog kunne fagocytose assays anvendes på andre fagocytter, såsom mus knoglemarv-afledte makrofager eller neutrofiler, musen makrofager cellelinjer, humane monocyt-afledte makrofager eller humant perifert blod neutrofiler. Menneskelige fagocytter eller mus neutrofiler, ville alternativ fluorescently mærket antistoffer være påkrævet, såsom fluorescently mærket anti-CD14 antistoffer (humane monocytter/makrofager)16 eller anti-Gr-1 (Ly – 6 G) antistoffer (mus neutrofiler).
Unopsonized menneskelige rød blod celler, som traditionelt anvendes får røde blodlegemer, er inaktiv i den forstand, at disse celler er ikke (eller, i det mindste, meget sjældent) indtages af musen peritoneal makrofager. Dette sikrer i modsætning til polystyren perler, lav baggrund aktivitet. Menneskets røde blodlegemer kan være bekvemt opsonized med immunoglobuliner ved hjælp af musen IgG eller IgM monoklonalt antistof mod CD235a (glycophorin A), en specifik markør for menneskelige erytrocytter (røde blodlegemer) og erythroid prækursorer17, 18. i parallelle assays, fluorescently mærket anti-mus IgG eller IgM sekundære antistoffer kan anvendes til at bekræfte opsonization. IgG og IgM-antistof klasser er hemagglutinins, stoffer (antistoffer), der forårsager røde blodlegemer til at agglutinere. For at undgå agglutination, vi Bland periodisk cellesuspension inkubation i perioden 8 min med anti-CD235a antistof, og så tilføjer vi blandet suspension direkte til en makrofag-holdige kanal dias (fibronektin-belagt slide) uden en vask trin . Vask skridt involverer sedimentation af røde blodlegemer ved centrifugering, som kraftigt fremmer agglutination. Før opsonizing menneskets røde blodlegemer, mærker vi plasma membran med en lipofile orange/rødt fluorescerende sonde. Denne sonde er smukt fluorescerende i begyndelsen af time-lapse optagelser, men signalet forsvinder gradvist, sandsynligvis i vid udstrækning photobleaching19. Derudover kan makrofager og fibronektin belægning af diaset blive svagt orange/rødt fluorescerende under optagelser. Dette problem er formentlig på grund af utilstrækkelig vask af menneskets røde blodlegemer efter mærkning. Istedet for benytter en lipofile fluorescerende plasmamembran markør, kan menneskets røde blodlegemer mærkes med et pH-følsom rodamin derivat ved hjælp af dens Amin reaktive succinimidyl ester15,20. Dette har fordelen, at visualisering af phagosome modning, da fluorescens intensiteten stiger med faldende pH15,20, men denne fremgangsmåde har den ulempe, at reaktive ester præparater er i øjeblikket dyrt og ustabile efter rekonstituering i vandigt medium.
IgG-opsonized menneskets røde blodlegemer indtages via FcγRs, som kan bekræftes ved hjælp af peritoneal makrofager isoleret fra NOTAM21 eller Fcer1g– / – (Fcer1g knockout) mus. NOTAM makrofager binde IgG-opsonized menneskets røde blodlegemer, men mangler ITAM (immunoreceptor tyrosin-baseret aktivering motiv) – medieret signalering kræves for at fremkalde fagocytose, hvorimod Fcer1g knockout makrofager ikke udtryk overflade FcγRs. IgG – eller IgM-opsonized menneskets røde blodlegemer kan desuden opsonized med C3b (som er kløvet til iC3b) ved at inkubere celler med frisk isolerede serum fra et supplement C5 null mus (vildtype serum forårsager hæmolyse). Opsonins IgG og IgM aktivere den klassiske supplement kaskade, der fører til dannelsen af porer (membran angreb komplekser) og celle lysering. I mus mangler supplement C5, supplement cascade provenuet til at supplere C3 kavalergang, men C5 convertase mangler substratet skal katalysere den terminal pathway. Vi udviklet enkle assays for at måle kinetik af supplement kaskade. Kort sagt, kan menneskets røde blodlegemer være co mærket med en fluorescerende rød, plasma membran markør og den grønne fluorescerende, cytosole fluorophore. Ved stiftelse af membran angreb komplekse, dannet af supplement komponenter C5-C9, det cytosole fluorophore er hurtigt (i sekunder) tabt fra cytosol. Visualisering af ende-effektor (cytolysis) funktion af supplement kaskade angivet, 4 min Inkubationstiden er tilstrækkelig for C3b/iC3b hjælp af menneskets røde blodlegemer. I parallel assays, kan C3b/iC3b belægning af menneskets røde blodlegemer nemt vurderes efter anvender en blanding af anti-mus C3b og fluorescently mærket sekundære antistoffer. I dette tilfælde er en vask skridt forpligtet til at fjerne ubundne fluorescerende antistoffer. Selv om wash skridt indebærer celle sedimentaion ved centrifugering, som fremmer agglutination, kan vellykket hjælp vurderes let ved Konfokal mikroskopi. Supplere receptor-medieret fagocytose kan være afbildet af enten anvende IgG- / iC3b-opsonized rød blod celler til NOTAM eller Fcer1g– / – makrofager eller ved at indføre IgM- / iC3b-opsonized rød blod celler til vildtype makrofager. IgM-opsonized blod celler genkendes ikke af den ITAM-holdige FcγRs (FcγRI, FcγRIII og FcγRIV) kræves til fagocytose af IgG-opsonized partikler22.
For at billede fagocyterende kan begivenheder, plasma membran af makrofager være mærket med grøn fluorescerende fluorophore konjugerede anti-F4/80 antistof, der også fungerer som en specifik markør for musen makrofager. Menneskets røde blodlegemer kan gengives rødt fluorescerende ved inkubering med en orange/rød fluorescerende plasmamembran markør, som beskrevet ovenfor. Denne lipofile plasmamembran markør undgår potentielle forstyrrende virkninger af antistof-baserede etiketter. Rødt fluorescerende menneskets røde blodlegemer, med eller uden hjælp, kan være direkte pipetted i 100 µL kanal af en kanal dias og 3D time-lapse afbildet via en 60 X / 1,49 olie nedsænkning (eller lignende) mål linse udføres ved hjælp af 488 nm og 561 nm laser linjer , henholdsvis, af en roterende disk Konfokal (eller lignende) mikroskop. Det er fristende at optimere systemet for høj opløsning imaging, men erhvervelse af gentagne Z-stakke over 16 min eller så kan forårsage betydelige photobleaching og fototoksicitet. Vi valgte at bruge 2 x 2 binning for at fremme god signal-støj-forhold og give reduktioner i excitation intensitet og/eller eksponering gange, men på bekostning af optisk opløsning. Derudover for at reducere fototoksicitet, tilføje vi en ådselsæder af reaktive ilt arter til medium. I fremtidige undersøgelser, kunne assays ændres for at billede fagocytose af apoptotiske menneskets røde blodlegemer. Anvendelse af en Ca2 + ionophor, såsom A23187, kan bruges til at fremkalde phosphatidylserin udlægning23, en “Spis mig” signal og kendetegnende for tidlige apoptose24,25.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af tilskud HA 3271/4-1 og HA 3271/4-2 fra DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft), og grant FF-2016-05 fra EXC 1003 (klynge Excellence 1003), celler i bevægelse (CiM), DFG.
24-G plastic catheter | B Braun Mesungen AG, Germany | 4254503-01 | Used for peritoneal lavage |
Hank’s buffered salt solution without Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14170120 | Used for peritoneal lavage |
14 ml polypropylene round bottom tubes | BD Falcon | 352059 | Used to collect peritoneal cells |
RPMI 1640 medium containing 20 mM Hepes | Sigma-Aldrich | R7388 | Basis medium for assays |
Heat-inactivated fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10082139 | Used as supplement for RPMI 1640 media |
100x penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Used as supplement for RPMI 1640 media |
Fibronectin-coated µ-Slide I chambers | Ibidi, Martinsried, Germany | 80102 | Channel slides used for assays |
µ-Slide (anodized aluminum) rack | Ibidi, Martinsried, Germany | 80003 | Autoclavable stackable rack for channel slides |
RPMI 1640 medium containing bicarbonate | Sigma-Aldrich | R8758 | Medium for overnight culture |
N-(2-mercaptopropionyl)glycine | Sigma-Aldrich | M6635 | Scavenger of reactive oxygen species |
Alexa Fluor 488-conjugated rat (IgG2a) monoclonal (clone BM8) anti-mouse F4/80 antibody | Thermo Fisher Scientific | MF48020 | Mouse macrophage marker and plasma membrane label |
CellMask Orange | Thermo Fisher Scientific | C10045 | Red fluorescent plasma membrane stain |
Succinimidyl ester of pHrodo | Thermo Fisher Scientific | P36600 | Amine-reactive succinimidyl ester of pHrodo |
Mouse (IgG2b) monoclonal (clone HIR2) anti-human CD235a | Thermo Fisher Scientific | MA1-20893 | Used to opsonize human red blood cells with IgG |
Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-mouse (secondary) IgG antibody | Abcam | Ab150116 | Used to confirm opsonization of human red blood cells with mouse IgG |
Rat anti-mouse C3b/iC3b/C3c antibody | Hycult Biotech | HM1065 | Used to confirm C3b/iC3b opsonization of human red blood cells |
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rat IgG antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11006 | Used as secondary antibody to confirm C3b/iC3b opsonization |
Calcein/AM | Thermo Fisher Scientific | C3100MP | Used to load human red blood cells with Calcein |
UltraVIEW Vox 3D live cell imaging system | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Spinning disk confocal microscope system | |
Nikon Eclipse Ti inverse microscope | Nikon, Japan | Inverted microscope | |
CSU-X1 spinning disk scanner | Yokogawa Electric Corporation, Japan | Nipkow spinning disk unit | |
14-bit Hamamatsu C9100-50 Electron Multiplying-Charged Couple Device (EM-CCD) peltier-cooled camera | Hamamatsu Photonics Inc., Japan | EM-CCD camera of the spinning disk confocal microscope system | |
488 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (488 nm) source of spinning disk confocal microscope system | |
561 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (561 nm) source of spinning disk confocal microscope system |