यहां हम माउस निवासी पेरिटोनियल मैक्रोफेज द्वारा छवि एकल phagocytic घटनाओं के लिए कताई डिस्क फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग तरीकों का वर्णन । अंय phagocytic कक्षों के लिए प्रोटोकॉल विस्तारित किया जा सकता है ।
Phagocytosis मेजबान रक्षा में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, के रूप में अच्छी तरह के रूप में ऊतक विकास और रखरखाव में, और तेजी से शामिल है, रिसेप्टर मध्यस्थता actin cytoskeleton के पुनर्व्यवस्थाओं पर कब्जा करने के लिए, ढंक और बड़े कणों निगलना. हालांकि phagocytic रिसेप्टर्स, बहाव संकेत रास्ते, और Rho GTPases के रूप में प्रभाव, की पहचान की गई है, विशिष्ट रिसेप्टर के गतिशील cytoskeletal remodeling-मध्यस्थता phagocytic घटनाओं अस्पष्ट रहते हैं. चार दशक पहले, phagocytosis के दो अलग तंत्र, Fcγ रिसेप्टर (FcγR) द्वारा उदाहरण-और पूरक रिसेप्टर (सीआर)-मध्यस्थता phagocytosis, स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर की पहचान की गई. immunoglobulin जी (आईजीजी) के बंधन-opsonized कण पतली झिल्ली एक्सटेंशन है, जो शुरू में कण के आसपास एक तथाकथित phagocytic कप फार्म के पहले यह पूरी तरह से संलग्न है और सेल में मुकर जाता है की दखलंदाजी चलाता है । इसके विपरीत, पूरक opsonized कणों रिसेप्टर्स पूरक करने के लिए बाध्यकारी निम्नलिखित phagocyte में सिंक करने के लिए दिखाई देते हैं. phagocytosis, phagocytic कप के गठन और डूब में इन दो मोड, साहित्य में अच्छी तरह से स्थापित हो गए हैं । हालांकि, दो मोड के बीच भेद रिपोर्टों है कि पूरक रिसेप्टर-मध्यस्थता phagocytosis विभिन्न झिल्ली की दखलंदाजी पैदा कर सकते हैं द्वारा धुंधला हो गया है. उच्च संकल्प इमेजिंग तकनीक की उपलब्धता के साथ, phagocytosis परख कि कैसे विशिष्ट phagocytic रिसेप्टर्स के व्यक्तिगत कणों के तेज मध्यस्थता की वास्तविक समय 3 डी (तीन आयामी) दृश्य की अनुमति की आवश्यकता है । इस तरह के अंत बिंदु परख के रूप में phagocytosis के अध्ययन के लिए अधिक सामांयतः इस्तेमाल किया दृष्टिकोण, को समझने की क्या कणों और फ़ैगोसाइट के इंटरफेस पर हो रहा है अवसर याद आती है । यहां हम phagocytic परख का वर्णन, समय का उपयोग चूक डिस्क फोकल माइक्रोस्कोपी कताई, कि एकल phagocytic घटनाओं के 3 डी इमेजिंग की अनुमति । इसके अलावा, हम स्पष्ट रूप से छवि Fcγ रिसेप्टर के लिए परख का वर्णन-या रिसेप्टर की मध्यस्थता phagocytosis पूरक.
तारामछली लार्वा में phagocytic mesenchyme कोशिकाओं के Metchnikoff अवलोकन से पहले बीस साल, १८८२ में, और1phagocytosis के अपने सिद्धांत के बाद विकास, अर्नेस्ट Haeckel, १८६२ में वर्णित, रक्त द्वारा अघुलनशील डाई कणों की समाई Thetis fimbris (टेथ्स fimbria), शिकारी सागर स्लग (अर्नेस्ट Haeckel की एक प्रजाति की कोशिकाओं । मर Radiolarien (Rhizopoda radiaria): Eine Monographie; Druck und Verlag वॉन Georg Reimer, बर्लिन, १८६२). वह स्पष्ट रूप से झिल्ली का पुलिंदा है, जो बाद में कोशिका द्रव्य में ले जाया गया था और कोशिका नाभिक के आसपास जमा ढंक । अधिक से अधिक १०० साल बाद, कापलान द्वारा एक अग्रणी अध्ययन का सुझाव दिया है कि वहां थे phagocytosis2में से कम दो आकृति विज्ञान अलग तंत्र । कापलान इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग के माध्यम से पता चला है कि माउस पेरिटोनियल मैक्रोफेज एक आईजीजी-opsonized भेड़ लाल रक्त पतली झिल्ली एक्सटेंशन जो ऊपर तक पहुंच और कसकर कण लिफाफा, शुरू में एक कप को जंम देने की तरह का उपयोग कर घूस दिया संरचना. Phagocytic कप गठन आवश्यक actin बहुलकीकरण चूंकि यह कोशिका-पारगंय फफूंद विष cytochalasin बी द्वारा निष्प्रभाव था, actin गतिकी3को ब्लॉक करने के लिए जाना जाता है । इसके विपरीत, पूरक के साथ भेड़ लाल रक्त कोशिकाओं opsonized झिल्ली एक्सटेंशन की पीढ़ी के बिना मैक्रोफेज में सीधे सिंक करने के लिए दिखाई दिया, हालांकि, कुछ छवियों में, झिल्ली व्याकुलता डूब कणों के तत्काल vacinity में देखा जा सकता है । phagocytic कप के गठन के विपरीत, रिसेप्टर पूरक मध्यस्थता में डूब cytochalasin बी उपचार2के लिए insenstive था. कापलान द्वारा वर्णित प्रयोगों में, पूरक opsonization मशीन द्वारा किया गया था immunoglobulin एम (आईजीएम) के लेबल वाली भेड़ लाल रक्त कोशिकाओं से सीरम के साथ पूरक c5-की कमी चूहों, जो hemolysis के पूरक द्वारा c5-निर्भर टर्मिनल जटिल पूरक ।
phagocytosis के दो तरीके, phagocytic कप के गठन और डूब में, कापलान द्वारा की पहचान की राय क्षेत्र में स्थापित हो गए है4,5,6,7,8,9 . हालांकि, अल्ट्रा उच्च संकल्प छवियों कापलान2द्वारा मूल अध्ययन में इस्तेमाल किया, साथ ही Munthe द्वारा एक समान अध्ययन-Kaas एट अल । 10, केवल phagocytic घटनाओं के स्नैपशॉट प्रदान करते हैं । हाल ही में एक समीक्षा में, Rougerie एट अल । 11 बल दिया कि FcγR-और सीआर-मध्यस्थता phagocytosis के बीच मतभेद रूपात्मक स्पष्ट किया जाना है, और, इसके अलावा, झिल्ली व्याकुलता पूरक रिसेप्टर-मध्यस्थता कण2के दौरान मनाया गया है. जीना-एकल phagocytic कण पर कब्जा से फैले internalization की घटनाओं के सेल इमेजिंग, आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस मॉडलों के साथ संयुक्त, बहुत कैसे फ़ैगोसाइट कब्जा और निगल कणों की हमारी समझ में सुधार कर सकता है । एक दृष्टिकोण के लिए तेजी से परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (AFM) जो अल्ट्रा उच्च संकल्प (10-20 एनएम) जीवित कोशिकाओं के स्थलाकृतिक इमेजिंग की अनुमति देता है का उपयोग हो सकता है । हाल ही में, एक फास्ट AFM प्रणाली12 विकसित किया गया है, जो इमेजिंग सेल कम शोर के साथ तेजी से सतहों के लिए उपयुक्त है । इस तकनीक का लाभ यह है कि उच्च संकल्प, स्थलाकृतिक और यांत्रिक मानकों के रहने वाले कोशिकाओं को कम अंतराल पर मापा जा सकता है (सेकंड), स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के विपरीत, जो आवश्यक निर्धारण और महत्वपूर्ण बिंदु सुखाने की कक्षों. हालांकि phototoxicity और ब्लीचिंग कारकों रिकॉर्डिंग के दौरान सीमित कर रहे हैं एक और दृष्टिकोण, समय चूक 3 डी फोकल माइक्रोस्कोपी है, जो व्यापक रूप से उपलब्ध है. इस दृष्टिकोण अत्यधिक बहुमुखी है और उच्च स्थानिक संकल्प के साथ ऑप्टिकल अनुभाग की अनुमति देता है और फ्लोरोसेंट जांच की एक चौंका देने वाला रेंज के साथ लेबलिंग में असाधारण लचीलापन सक्षम बनाता है, आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट प्रोटीन सहित । यहां हम समय का उपयोग कर phagocytosis परख का वर्णन-चूक कताई डिस्क फोकल माइक्रोस्कोपी कि अनुमति उच्च विशिष्ट रिसेप्टर के spatiotemporal संकल्प-phagocytic घटनाओं मध्यस्थता ।
phagocytosis परख के विशाल बहुमत, विशेष रूप से अंत बिंदु और उच्च प्रवाह परख, कैसे कणों वास्तव में कब्जा कर रहे हैं, के दृश्य प्रदान नहीं कर रहे है और लिफाफे में घूस लिया । Munthe द्वारा अग्रणी अध्ययन-Kaas एट अल । 10 और 1970 के दशक में2 कापलान सुझाव दिया है कि हड़ताली अलग cytoskeletal पुनर्गठन आईजीजी के phagocytosis में शामिल-opsonized बनाम पूरक opsonized कणों (भेड़ लाल रक्त कोशिकाओं) थे । यहां हम phagocytosis का वर्णन परख कताई डिस्क फोकल माइक्रोस्कोपी जो उच्च संकल्प, वास्तविक समय एकल phagocytic घटनाओं के इमेजिंग की अनुमति का उपयोग कर । हमारे मॉडल phagocyte माउस निवासी पेरिटोनियल मैक्रोफेज है, जो कम से निपटने के साथ अलग किया जा सकता है, और हम कणों के रूप में हौसले से पृथक मानव लाल रक्त कोशिकाओं का उपयोग करें । हालांकि, phagocytosis परख अंय फ़ैगोसाइट के लिए लागू किया जा सकता है, जैसे माउस अस्थि मज्जा-व्युत्पंन मैक्रोफेज या न्यूट्रोफिल, माउस मैक्रोफेज सेल लाइंस, मानव monocyte-व्युत्पंन मैक्रोफेज या मानव परिधीय रक्त न्यूट्रोफिल । मानव फ़ैगोसाइट या माउस न्यूट्रोफिल के मामले में, वैकल्पिक फ्लोरोसेंट लेबल एंटीबॉडी की आवश्यकता होगी, जैसे फ्लोरोसेंट लेबल विरोधी CD14 एंटीबॉडी (मानव monocytes/मैक्रोफेज)16 या विरोधी जीआर-1 (6G) एंटीबॉडी (माउस न्यूट्रोफिल) ।
Unopsonized मानव लाल रक्त कोशिकाओं, पारंपरिक रूप से इस्तेमाल किया भेड़ लाल रक्त कोशिकाओं की तरह, इस अर्थ है कि इन कोशिकाओं को नहीं कर रहे हैं में निष्क्रिय कर रहे हैं (या, कम, बहुत शायद ही कभी) माउस पेरिटोनियल मैक्रोफेज द्वारा घूस. यह सुनिश्चित करता है, polystyrene मोतियों के विपरीत, कम पृष्ठभूमि गतिविधि. मानव लाल रक्त कोशिकाओं को आसानी से माउस आईजीजी या मोनोक्लोनल के खिलाफ आईजीएम CD235a एंटीबॉडी का उपयोग इम्युनोग्लोबुलिन के साथ opsonized जा सकता है (glycophorin ए), मानव एरिथ्रोसाइट्स के एक विशिष्ट मार्कर (लाल रक्त कोशिकाओं) और erythroid के अग्रदूतों17, 18. समानांतर परख में, फ्लोरोसेंट लेबल विरोधी माउस आईजीजी या आईजीएम माध्यमिक एंटीबॉडी opsonization पुष्टि करने के लिए लागू किया जा सकता है । आईजीजी और आईजीएम एंटीबॉडी वर्गों hemagglutinins, पदार्थ (एंटीबॉडी) कि लाल रक्त कोशिकाओं के कारण agglutinate हैं । समूहन से बचने के लिए, हम आवर्तक रूप CD235a एंटीबॉडी के साथ 8 मिनट की मशीन अवधि के दौरान सेल निलंबन मिश्रण, और फिर हम मिश्रित निलंबन सीधे एक मैक्रोफेज-युक्त चैनल स्लाइड (fibronectin-लेपित स्लाइड) एक धोने कदम के बिना जोड़ने . धो चरणों केंद्रापसारक द्वारा लाल रक्त कोशिकाओं के अवसादन शामिल है, जो दृढ़ता से समूहन को बढ़ावा देता है । opsonizing मानव लाल रक्त कोशिकाओं से पहले, हम एक lipophilic नारंगी/लाल फ्लोरोसेंट जांच के साथ प्लाज्मा झिल्ली लेबल । इस जांच चमकीले समय की शुरुआत में फ्लोरोसेंट है चूक रिकॉर्डिंग, लेकिन संकेत धीरे से फ़ेड, शायद मोटे तौर पर19photobleaching के कारण । इसके अलावा, मैक्रोफेज और स्लाइड के fibronectin कोटिंग कमजोर नारंगी/रिकॉर्डिंग के दौरान लाल फ्लोरोसेंट हो सकता है । यह समस्या संभवतः लेबलिंग के बाद मानव लाल रक्त कोशिकाओं के अपर्याप्त धोने के कारण है । इसके बजाय एक lipophilic फ्लोरोसेंट प्लाज्मा झिल्ली मार्कर का उपयोग कर के, मानव लाल रक्त कोशिकाओं को एक पीएच के साथ लेबल किया जा सकता है संवेदनशील rhodamine अपने अमीन प्रतिक्रियाशील succinimidyl एस्टर15,20का उपयोग कर व्युत्पंन । यह कम पीएच15,20के साथ प्रतिदीप्ति तीव्रता बढ़ जाती है के बाद से phagosome परिपक्वता के दृश्य की अनुमति का लाभ है, लेकिन इस दृष्टिकोण नुकसान है कि प्रतिक्रियाशील एस्टर की तैयारी वर्तमान में कर रहे है महंगा और अस्थिर जलीय माध्यम में पुनर्गठन के बाद ।
आईजीजी-opsonized मानव लाल रक्त कोशिकाओं FcγRs, जो मैक्रोफेज21 या नोटं-/-(Fcer1g नॉकआउट) चूहों से अलग पेरिटोनियल Fcer1g का उपयोग कर पुष्टि की जा सकती है के माध्यम से घूस ले रहे हैं । नोटं मैक्रोफेज बाँध आईजीजी-opsonized मानव लाल रक्त कोशिकाओं, लेकिन कमी आईटम (immunoreceptor tyrosine-आधारित सक्रियण आकृति)-मध्यस्थता संकेत phagocytosis प्रेरित करने के लिए आवश्यक है, जबकि Fcer1g नॉकआउट मैक्रोफेज सतह FcγRs व्यक्त नहीं करते. आईजीजी- या आईजीएम-opsonized मानव लाल रक्त कोशिकाओं को इसके अतिरिक्त C3b के साथ opsonized जा सकता है (जो iC3b से सट जाता है) एक पूरक C5 नल माउस (जंगली-प्रकार सीरम कारण hemolysis) से ताजा अलग सीरम के साथ कोशिकाओं को मशीन द्वारा । opsonins आईजीजी और आईजीएम शास्त्रीय झरना, जो pores के गठन की ओर जाता है पूरक (झिल्ली हमला परिसरों) और सेल lysis सक्रिय करें । में चूहों कमी पूरक c5, झरना पूरक के लिए C3 दरार के पूरक हैं, लेकिन C5 convertase टर्मिनल मार्ग उत्प्रेरित करने के लिए आवश्यक सब्सट्रेट का अभाव है. हम सरल परख विकसित करने के लिए कैनेटीक्स झरना के पूरक उपाय । संक्षेप में, मानव लाल रक्त कोशिकाओं को एक लाल फ्लोरोसेंट, प्लाज्मा झिल्ली मार्कर और हरी फ्लोरोसेंट, cytosolic fluorophore के साथ सह-लेबल किया जा सकता है । झिल्ली हमला जटिल के गठन पर, C5-C9 घटकों के पूरक द्वारा गठित, cytosolic fluorophore तेजी से (सेकंड में) cytosol से खो दिया है । अंत के दृश्य-प्रभाव (cytolysis) समारोह के पूरक झरना का संकेत दिया है कि 4 मिनट की मशीन समय C3b/iC3b opsonization मानव लाल रक्त कोशिकाओं के लिए पर्याप्त है । समानांतर परख में, C3b/मानव लाल रक्त कोशिकाओं के iC3b कोटिंग विरोधी माउस C3b और फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी लेबल का एक मिश्रण लागू करने के बाद आसानी से मूल्यांकन किया जा सकता है । इस मामले में, एक धोने कदम असीम फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी को दूर करने के लिए आवश्यक है । हालांकि धोने कदम sedimentaion द्वारा सेल शामिल है, जो समूहन को बढ़ावा देता है, सफल opsonization आसानी से फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है । पूरक रिसेप्टर-मध्यस्थता phagocytosis या तो आवेदन आईजीजी-/iC3b-opsonized मानव लाल रक्त कोशिकाओं को नोटं या Fcer1g-/मैक्रोफेज या आईजीएम-/iC3b-opsonized मानव लाल रक्त कोशिकाओं जंगली-प्रकार मैक्रोफेज करने के लिए शुरू करने से imaged जा सकता है । आईजीएम-opsonized रक्त कोशिकाएँ FcγRIII-FcγRIV कणों की phagocytosis के लिए आवश्यक आईटम-युक्त FcγRs (FcγRI, आईजीजी और opsonized) द्वारा मान्यता प्राप्त नहींहैं.
छवि phagocytic घटनाओं के लिए, मैक्रोफेज के प्लाज्मा झिल्ली हरी फ्लोरोसेंट fluorophore संयुग्मित विरोधी F4/80 एंटीबॉडी, जो भी माउस मैक्रोफेज के एक विशिष्ट मार्कर के रूप में कार्य करता है के साथ लेबल किया जा सकता है । मानव लाल रक्त कोशिकाओं को एक नारंगी/लाल फ्लोरोसेंट प्लाज्मा झिल्ली मार्कर के साथ मशीन द्वारा लाल फ्लोरोसेंट गाया जा सकता है, के रूप में ऊपर चर्चा की । यह lipophilic प्लाज्मा झिल्ली मार्कर एंटीबॉडी आधारित लेबल के संभावित निराधार प्रभाव से बचा जाता है । लाल फ्लोरोसेंट मानव लाल रक्त कोशिकाओं के साथ या बिना opsonization, सीधे एक चैनल स्लाइड के १०० µ एल चैनल में pipetted जा सकता है और 3 डी समय-एक 60X/1.49 तेल विसर्जन (या इसी तरह) उद्देश्य लेंस के माध्यम से imaged चूक ४८८ एनएम और ५६१ एनएम लेजर लाइनों का उपयोग कर प्रदर्शन , क्रमशः एक कताई डिस्क की (या इसी तरह) माइक्रोस्कोप । यह उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए प्रणाली का अनुकूलन करने के लिए आकर्षक है, लेकिन 16 मिनट से अधिक दोहराया Z-पोट या तो काफी photobleaching और phototoxicity कारण हो सकता है के अधिग्रहण । हम अच्छा संकेत करने के लिए शोर अनुपात को बढ़ावा देने और उत्तेजना तीव्रता और/या जोखिम समय में कटौती की अनुमति 2×2 बिन्नी का उपयोग करने के लिए चुना है, लेकिन ऑप्टिकल संकल्प की कीमत पर । इसके अलावा, phototoxicity को कम करने के लिए, हम मध्यम करने के लिए प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों में से एक मेहतर जोड़ें । भविष्य के अध्ययनों में, परख अपोप्तोटिक मानव लाल रक्त कोशिकाओं के phagocytosis छवि को संशोधित किया जा सकता है । इस तरह के A23187 के रूप में एक Ca2 + ionophore, के आवेदन, phosphatidylserine externalization23प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता, एक “मुझे खाओ” संकेत और जल्दी24,25की पहचान apoptosis.
The authors have nothing to disclose.
यह काम अनुदान के द्वारा समर्थित किया गया हा 3271/4-1 और हा 3271/4-2 से DFG (ड्यूश Forschungsgemeinschaft), और अनुदान एफएफ-2016-05 से EXC १००३ (क्लस्टर ऑफ एक्सीलेंस १००३), प्रमोशन में सेल (यूके), DFG.
24-G plastic catheter | B Braun Mesungen AG, Germany | 4254503-01 | Used for peritoneal lavage |
Hank’s buffered salt solution without Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14170120 | Used for peritoneal lavage |
14 ml polypropylene round bottom tubes | BD Falcon | 352059 | Used to collect peritoneal cells |
RPMI 1640 medium containing 20 mM Hepes | Sigma-Aldrich | R7388 | Basis medium for assays |
Heat-inactivated fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10082139 | Used as supplement for RPMI 1640 media |
100x penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Used as supplement for RPMI 1640 media |
Fibronectin-coated µ-Slide I chambers | Ibidi, Martinsried, Germany | 80102 | Channel slides used for assays |
µ-Slide (anodized aluminum) rack | Ibidi, Martinsried, Germany | 80003 | Autoclavable stackable rack for channel slides |
RPMI 1640 medium containing bicarbonate | Sigma-Aldrich | R8758 | Medium for overnight culture |
N-(2-mercaptopropionyl)glycine | Sigma-Aldrich | M6635 | Scavenger of reactive oxygen species |
Alexa Fluor 488-conjugated rat (IgG2a) monoclonal (clone BM8) anti-mouse F4/80 antibody | Thermo Fisher Scientific | MF48020 | Mouse macrophage marker and plasma membrane label |
CellMask Orange | Thermo Fisher Scientific | C10045 | Red fluorescent plasma membrane stain |
Succinimidyl ester of pHrodo | Thermo Fisher Scientific | P36600 | Amine-reactive succinimidyl ester of pHrodo |
Mouse (IgG2b) monoclonal (clone HIR2) anti-human CD235a | Thermo Fisher Scientific | MA1-20893 | Used to opsonize human red blood cells with IgG |
Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-mouse (secondary) IgG antibody | Abcam | Ab150116 | Used to confirm opsonization of human red blood cells with mouse IgG |
Rat anti-mouse C3b/iC3b/C3c antibody | Hycult Biotech | HM1065 | Used to confirm C3b/iC3b opsonization of human red blood cells |
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rat IgG antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11006 | Used as secondary antibody to confirm C3b/iC3b opsonization |
Calcein/AM | Thermo Fisher Scientific | C3100MP | Used to load human red blood cells with Calcein |
UltraVIEW Vox 3D live cell imaging system | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Spinning disk confocal microscope system | |
Nikon Eclipse Ti inverse microscope | Nikon, Japan | Inverted microscope | |
CSU-X1 spinning disk scanner | Yokogawa Electric Corporation, Japan | Nipkow spinning disk unit | |
14-bit Hamamatsu C9100-50 Electron Multiplying-Charged Couple Device (EM-CCD) peltier-cooled camera | Hamamatsu Photonics Inc., Japan | EM-CCD camera of the spinning disk confocal microscope system | |
488 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (488 nm) source of spinning disk confocal microscope system | |
561 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (561 nm) source of spinning disk confocal microscope system |