Een protocol voor het productieproces van polymere dunne film composiet structuren bezitten verschillende Youngs moduli of diktes wordt gepresenteerd. Films worden geproduceerd voor geavanceerde cel Cultuurwetenschappen of als huid lijm.
In dit protocol presenteren wij methoden om dunne elastomeer samengestelde films voor geavanceerde cel cultuur toepassingen en voor de ontwikkeling van de huid lijm. Twee verschillende poly–(dimethyl siloxanes) (PDMS en zachte huid lijm (SSA)), zijn gebruikt voor diepgaand onderzoek van biologische effecten en zelfklevende kenmerken. De samengestelde films bestaan uit een flexibele steun laag en een lijm bovenlaag. Beide lagen zijn vervaardigd door doctor blade toepassing techniek. In het huidige onderzoek is het zelfklevende gedrag van de samengestelde films onderzocht als een functie van de laagdikte of een variatie van de Youngs modulus van de toplaag. De Youngs modulus voor PDMS veranderd door het variëren van de basis om te crosslinker mengverhouding. Bovendien, de dikte van SSA films heeft geweest varieerde van ca. 16 µm tot ca. 320 µm. scannende elektronen microscoop (SEM) en optische microscopie zijn gebruikt voor diktemetingen. De adhesieve eigenschappen van elastomeer films zijn sterk afhankelijk van de laagdikte, de Youngs modulus van de polymeren en de oppervlakte kenmerken. Daarom, normale hechting van deze films op glazen substraten tentoonstellen van gladde en ruwe oppervlakken is onderzocht. Pull-off stress en werk van scheiding zijn afhankelijk van de mengverhouding van silicone-elastomeren.
Bovendien is de dikte van de lijm van de zachte huid geplaatst bovenop een laag ondersteunende steun varieerde om te produceren van patches voor toepassingen van de huid. Cytotoxiciteit, proliferatie en cellulaire hechting van L929 lymfkliertest fibroblasten op PDMS films (mengverhouding 10:1) en SSA films (mengen verhouding 50:50) zijn uitgevoerd. Wij hebben hier is afgebeeld, voor de eerste keer, de side by side vergelijking van dunne samengestelde films vervaardigd van beide polymeren en presenteren van het onderzoek naar de eigenschappen van hun biologische- en lijm.
In dit protocol, worden gedetailleerde methoden voor productie van dunne elastomeer films gepresenteerd. De verkrijgbaar doctor blade techniek is gebruikt voor de productie van dunne samengestelde films. De productietechniek heeft verricht voor polyethylenterephtalate (PET)-folie, waardoor de productie van deze films op grote schaal. De nadruk van dit protocol is de beoordeling van de reproduceerbaarheid, precieze productie van de verschillende lagen van de samengestelde films en bepaling van de hechting aan en de biologische eigenschappen van de uiteindelijke samengestelde patch. De silicone-elastomeer poly-(dimethylsiloxane) (PDMS) wordt uitgebreid gebruikt in biomedische technologie, met inbegrip van de productie van de huid lijm, microfluidics toepassingen en aanvullend onderzoek velden1,2,3 ,4. Een subklasse van PDMS, zogenaamde zachte huid lijmen (BVS) hebben onlangs geïntroduceerde, in het bijzonder voor zachte huid verlijmen en -binding.
Siliconen BVS zijn vinyl matiemaatschappij elastomeren, analoog polymeren afwijken door het ontbreken van silica5te versterken. Gelijkaardig aan andere PDMS, SSA Youngs modulus kan worden aangepast in een brede waaier door modulerende cross-linker concentratie of genezen tijd6,–7,8. Deze wijziging in Youngs modulus van silicone-elastomeren aanzienlijk is van invloed op de adhesieve eigenschappen van het materiaal en heeft ook ingrijpende gevolgen op prokaryote en eukaryote cellen gekweekt op de oppervlakte9,10 , 11. op het niveau van de cellulaire biologische werd aangetoond, dat de eukaryote cellen reageren op het signaaltransductie niveau aan een modulatie van de elasticiteit van de matrix de dikte van de oppervlakte9,10,12 ,13,14. Er bestaan dus, een brede interesse in cel cultuur toepassingen van polymeren met afstembare mechanische eigenschappen. Nog belangrijker is, voorziet de intrinsiek lage oppervlakte-energie van siliconen gebaseerd elastomeren niet in optimale omstandigheden voor de cultuur van de cel van eukaryote cellen. Zuurstof plasma behandeling is een veel gebruikte techniek toe PDMS oppervlakte energiezuinige tijdelijk, wat leidt tot een verbetering van zijn sterkte pull-off, daalde oppervlakte adsorptie van moleculen, terwijl parallel bevordering van gehechtheid, verspreiding en proliferatie van eukaryotische cellen15,16,17,18.
Naast de eigenschappen van de materialen, de oppervlakte topografie grote invloed op cellulaire hechting en de zelfklevende interactie tussen twee materialen19,20,21,22. Oppervlakteruwheid heeft verschillende effecten op het contact vorming tussen twee oppervlakken: vermindering van het contactoppervlak, hoge opgeslagen elastische energie omringende oneffenheden evenals invloed op de voortplanting van de barst kan veranderen de adhesieve kracht23, 24. Hechting van zelfklevende films aan de menselijke huid is een opkomende toepassingsveld, bijvoorbeeld wond dressings, fixatie van ECG elektroden of andere draagbare elektronische apparaten25,26,27, 28. Voor het meten van de zelfklevende prestaties van zelf-lijmen met betrekking tot de oppervlakte topografie, kunnen glazen substraten met variërende graden van ruwheid worden gebruikt in normale hechting metingen8,21. Hier zijn twee glazen substraten te onderzoeken de adhesieve eigenschappen van de polymeerlagen geselecteerd. Eerste, samengestelde films met een PDMS steun laag in een mengverhouding van 10 tot en met 1 gewicht delen door PDMS bedekt met verschillende mengverhouding werden gekenmerkt. In een tweede stap was een kleeflaag van SSA bereid met gelijk gewicht hoeveelheden van beide componenten en met variërende laagdikte op de top van een ondersteunende PDMS film.
Het ontwerp van composiet structuren kan de eenvoudige aanpassing van de eigenschappen van het materiaal, zoals Youngs modulus of de dikte van de monsters. De Youngs modulus voor PDMS kan effectief worden gewijzigd in een brede waaier door de mengverhouding tussen deze twee onderdelen wijzigen of vervaardiging van mengsels met behulp van een verschillende silicone-elastomeer30,31. De beschreven methoden zijn niet beperkt tot het PDMS van gebruikt in het huidige onderzoek, maar vooral de prestaties van de lijm hangt sterk af van het specifieke type wordt gebruikt. Een kritieke stap binnen dit protocol is het productieproces van de samengestelde films (Figuur 1). Het bleek dat de dikte van de films sterk het gedrag van de hechting van de films op verschillende ondergronden beïnvloedt, met inbegrip van de huid (Figuur 5 en Figuur 6). Naast de laagdikte, tijd- en temperatuurdisplays tijdens het genezen is van invloed op de eigenschappen van het materiaal-32. Parameters als de dikte van de polymere lagen moeten daarom zorgvuldig worden aangepast en geverifieerd.
Analyse van de adhesieve eigenschappen van de dunne films werd uitgevoerd met de normaalkracht hechting metingen met behulp van twee glazen substraten met verschillende oppervlakte ruwheid tot Ra = 0.338 µm (Figuur 3). In het algemeen, de ruwheid invloed aanzienlijk de hechting van oppervlakken, met name van elastische materialen33,34. De ruwheid van glas kan gemakkelijk worden gevarieerd door schuren met schuurpapier van verschillende asperity afmetingen, waardoor de fabricatie van substraten vertonen hogere waarden van de ruwheid21. In toevoeging, andere materialen, kan bijvoorbeeld epoxyhars worden gebruikt voor de productie van substraten15,35. Dit zou een ingrijpende wijziging-strategie van de gepresenteerde protocol. Bijvoorbeeld, als substraten tentoonstellen van verschillende oppervlakte vrije energieën nodig of specifieke zijn topografieën vereist. Hier, werden pull-off stress en werk van de scheiding van de dunne films geproduceerd voor PDMS en SSA geanalyseerd met een op maat gemaakte setup (macroscopische hechting meting apparaat (MAD, Figuur 4)). 36 optische uitlijning van substraat en indenter is een cruciale stap voor de analyse van de meetresultaten. Daarom moet de aanpassing van de tilt hoek met de goniometer, zo nauwkeurig mogelijk uit te voeren. Dit kan worden bereikt met voldoende nauwkeurigheid doordat handmatig het substraat in contact met het oppervlak van de film tot een horizontale contactpersoon is bereikt.
In het huidige protocol was de wachtruimte tijd constant gehouden op één seconde (Figuur 5 en Figuur 7). Vooral voor het onderzoek van de zelfklevende prestaties van een elastische film op een ruwe ondergrond oppervlak biedt een uitbreiding van de wacht tijd aanvullende informatie. Bijvoorbeeld, is een toename van de stress-pull-off met toenemende greep tijd gerapporteerde8geweest. Naast de metingen in het huidige protocol, andere methoden, bijvoorbeeld peel tests kunnen worden uitgevoerd, waardoor een meer omvattende onderzoek van hechting prestaties37.
De adhesieve eigenschappen van samengestelde films vertonen verschillende film diktes van de zachte huid lijm werden vastgesteld (Figuur 7). Onze resultaten zijn in overeenstemming met de gepubliceerde gegevens, waaruit blijkt dat een daling van film dikte leiden tot een toename van de stress pull-off als de opsluiting, dat wil zeggen, de verhouding tussen substraat diameter en film dikte, verhogingen38,39 . Op basis van deze resultaten en de gegevens die zijn afgebeeld in Figuur 7, concluderen we dat samengestelde films met een totale dikte van ca. 100 µm (een dikte van de laag van de SSA van ca. 60 µm toegepast op een PDMS-film met een dikte van circa 40 µm) gunstige hechting p vertonen eigenschappen op ruwe oppervlakken.
Vervolgens experimenten aan de karakterisering van biologische gerelateerde hebben verricht voor de ongerepte samengestelde films en plasma behandeld samengestelde films (Figuur 8). Plasma behandeling van silicium elastomeren is een vaak toegepaste, veelzijdige techniek te verhogen de hydrofiele eigenschappen van oppervlakken en het bevorderen van cellulaire gehechtheid en mobiele verspreiding van40,41. Siliconen staan bekend om hun lage toxiciteit en de hoge biostability maar kunnen bevatten residuele monomeren of katalysatoren die fysiologische processen, leidt ook tot cytotoxiciteit42,43kunnen beïnvloeden. In de uitgevoerde experimenten die we hebben waargenomen minder dan 5% cytotoxiciteit met LDH release als een indicator en een Trypan blauw uitsluiting assay. In het voorgestelde protocol, de gehele cellulaire bevolking, met inbegrip van cellulaire aggregaten vrijstaande vorm die het oppervlak heeft geanalyseerd voor proliferatie analyse (figuur 9B). Een wijziging van het protocol kan meer gedifferentieerde resultaten opleveren. Voor elk monster, kon het supernatant met vrijstaande cellulaire aggregaten worden overgebracht naar een aparte reactiebuis en niet gecombineerd met de cellen enzymatisch verwijderd van het oppervlak van het polymeer. Dat zou mogelijk de exacte beoordeling van cellen die zijn gekoppeld aan het oppervlak en uiteindelijk het onthullen van een meer gedetailleerde bepaling van de invloed van de polymeren vallende op het proces van cellulaire hechting. Naast de immunocytochemische methoden hier gepresenteerd, misschien cellen met immunoblot methoden, waardoor een gedetailleerde kwantitatieve beoordeling van eiwit expressie voor onderzoek worden geoogst.
Kortom, hebben wij vastgesteld productie voorwaarden voor de productie van dunne elastomere samengestelde films voor toepassingen in geavanceerde celonderzoek cultuur. Bovendien bezitten deze dunne lagen hoog aanpassingsvermogen huid ruwheid, waardoor geavanceerde ontwerp van huid lijm.
The authors have nothing to disclose.
Martin Danner is erkend voor zijn hulp bij de voorbereiding van de monsters en de vaststelling van cel cultuur procedures. De auteurs bedank Biesterfeld Spezialchemie GmbH (Hamburg, Duitsland), met name Robert Radsziwill voor continue ondersteuning en discussies. Het onderzoek leidt tot deze resultaten heeft financiering ontvangen van de Europese Onderzoeksraad onder de Europese Unie zevendekaderprogramma (FP/2007-2013) ERC subsidieovereenkomst n. 340929.
2-Propanol, 97% | Stockmeier Chemie | 1000452610000 | Isopropanol |
Abrasive diamnod hand pad | Bohle | MO 5007522 | Grit: 220 |
Accutase | Capricorn Scientific | ACC-1B | |
Albumin Fraktion V | Roth | 0163.2 | BSA |
Alexa Fluor 488 Phalloidin | ThermoFischer Scientific | A12379 | highly toxic |
Aquamount | Polysciences | 18606-20 | water soluble mounting medium |
CytoTox-ONE Homogeneous Membrane Integrity Assay | Promega | G7890 | |
DPBS, without Ca2+, Mg2+ | ThermoFischer Scientific | 14190094 | |
Fetal bovine serum gold | GE Health Care Life Science | A15-151 | FBS |
Goniometer OCA35 | Dataphysics | for the determination of the static water contact angle | |
Hoechst Dye 33342 | Sigma-Aldrich | B1155-100MG | bisBenzimide H 33342 trihydrochloride, highly toxic |
Microscope Axiovert 25 | Zeiss | Microscope used for cell culture documentation | |
Microscope Eclipse LV100ND | Nikon | Microscope used for film thickness determination | |
Paraformaldehyde, aqueous solution 16% | Electron Microscopy Sciences | RT 15710 | electron microscopy grade |
penicillin und streptomycin solution | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | |
Phenom XL Scanning Electron Microscope (SEM) | Phenom | ||
Poly-(vinyl alcohol) 4-88, MW 31000 | Sigma-Aldrich | 81381-1KG | Mowiol 4-88 |
Poly-dimethyl siloxanes, Sylgard 184 | Dow Corning | (400)000108351397 | PDMS |
RPMI 1640 basal medium | ThermoFischer Scientific | 21875034 | |
soft skin adhesive (SSA) | Dow Corning | (400)000108251792 | MG 7-9800 Soft Skin Adhesive (SSA) |
speed mixer DAC 600.2 VAC-P | Hauschild | ||
stylus profilomter | Zeiss | Model: SURFCOM 1500SD3 | |
Tecan Infinite M200 pro | Tecan | fluorescence plate reader | |
Triton X 100 | Calbiochem | 648466 | |
Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | T8154-100ML | highly toxic |
Trypsin/EDTA solution | PAN-Biotech | P10-023500 | 0.05% Trypsin, 0.02% EDTA in PBS |
UV glue | Bohle | BO MV76002 | medium viscosity |