बहुलक पतली फिल्म मिश्रित संरचनाओं के निर्माण की प्रक्रिया के लिए एक प्रोटोकॉल या तो अलग है युवा moduli या मोटाई रखने प्रस्तुत किया है । फिल्मों उंनत सेल संस्कृति अध्ययन के लिए या त्वचा चिपकने के रूप में उत्पादित कर रहे हैं ।
इस प्रोटोकॉल में, हम उंनत सेल संस्कृति अनुप्रयोगों के लिए पतली elastomer समग्र फिल्मों के निर्माण के लिए और त्वचा चिपकने के विकास के लिए तरीकों वर्तमान । दो अलग पाली-(dimethyl siloxanes) (PDMS और नरम त्वचा चिपकने वाला (SSA)), जैविक प्रभाव और चिपकने वाली विशेषताओं की गहराई से जांच के लिए इस्तेमाल किया गया है । कंपोजिट फिल्मों एक लचीला समर्थन परत और एक चिपकने वाला शीर्ष कोटिंग से मिलकर बनता है । दोनों परतों डॉक्टर ब्लेड आवेदन तकनीक द्वारा निर्मित किया गया है । वर्तमान जाँच में समग्र फिल्मों के चिपकने वाले व्यवहार की जाँच की गई है, परत मोटाई के एक समारोह के रूप में या शीर्ष परत के जवान की मापांक की भिन्नता है. crosslinker मिश्रण अनुपात को आधार से अलग करके PDMS की युवतियों की मापांक को बदल दिया गया है. इसके अलावा एसएसए फिल्मों की मोटाई लगभग 16 µm से लगभग ३२० µm तक विविध रही है । स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) और ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी मोटाई माप के लिए इस्तेमाल किया गया है । elastomer फिल्मों के चिपकने वाले गुण फिल्म मोटाई, युवा की मापांक बहुलक और सतह विशेषताओं पर दृढ़ता से निर्भर करते हैं । इसलिए, चिकनी और किसी न किसी सतहों का प्रदर्शन कांच सब्सट्रेट पर इन फिल्मों के सामान्य आसंजन जांच की गई है । खींचो तनाव और जुदाई का काम सिलिकॉन elastomers के मिश्रण अनुपात पर निर्भर हैं ।
इसके अतिरिक्त, नरम त्वचा चिपकने वाला एक सहायक समर्थन परत के शीर्ष पर रखा की मोटाई क्रम में त्वचा अनुप्रयोगों के लिए पैच का उत्पादन करने के लिए विविध किया गया है । PDMS फिल्मों (मिश्रण अनुपात 10:1) और एसएसए फिल्मों (मिश्रण अनुपात 50:50) पर L929 murine fibroblasts के Cytotoxicity, प्रसार और सेलुलर आसंजन आयोजित किया गया है । हम यहां दिखाया गया है, पहली बार के लिए, दोनों पॉलिमर से निर्मित पतली समग्र फिल्मों की ओर तुलना द्वारा पक्ष और उनके जैविक और चिपकने वाला गुण की जांच वर्तमान ।
इस प्रोटोकॉल में, पतली elastomer फिल्मों के निर्माण के लिए विस्तृत तरीकों प्रस्तुत कर रहे हैं । पतली समग्र फिल्मों के उत्पादन के लिए व्यापक रूप से उपलब्ध डॉक्टर ब्लेड तकनीक का इस्तेमाल किया गया है । विनिर्माण तकनीक पॉलीएथीलीनटरफैटेलेट (पीईटी) पन्नियों पर प्रदर्शन किया गया है, बड़े पैमाने पर इन फिल्मों के बाद उत्पादन को सक्षम करने के. इस प्रोटोकॉल का जोर reproducibility के मूल्यांकन, समग्र फिल्मों और अंतिम समग्र पैच के जैविक और आसंजन गुणों के निर्धारण के विभिंन परतों के सटीक निर्माण है । सिलिकॉन elastomer पाली-(dimethylsiloxane) (PDMS) बड़े पैमाने पर त्वचा चिपकने वाले, microfluidics अनुप्रयोगों और अतिरिक्त अनुसंधान क्षेत्रों के उत्पादन सहित जैव चिकित्सा प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में प्रयोग किया जाता है1,2,3 ,4. हाल ही में, PDMS के एक अंय उपवर्ग, तथाकथित नरम त्वचा चिपकने वाले (SSAs) शुरू किया गया है, कोमल त्वचा संबंध और de-संबंध के लिए विशेष रूप से ।
सिलिकॉन SSAs elastomers कार्यात्मक vinyl हैं, एनालॉग पॉलिमर से अलग सिलिका5मजबूत के अभाव द्वारा । अन्य PDMS के लिए इसी तरह, एसएसए के Young’s मापांक क्रॉस-लिंकर एकाग्रता या समय6,7,8का इलाज नियमन द्वारा एक विस्तृत श्रृंखला में अनुकूलित किया जा सकता है । सिलिकॉन elastomers के युवा मापांक में यह परिवर्तन महत्वपूर्ण सामग्री के चिपकने वाला गुण को प्रभावित करता है और prokaryotic और eukaryotic कोशिकाओं पर भी गहरा परिणाम है सतह9,10 पर कल्चरित , 11. सेलुलर जैविक स्तर पर, यह दिखाया गया था, कि eukaryotic कोशिकाओं संकेत transduction स्तर मैट्रिक्स लोच या सतह9,10,12 की मोटाई का एक मॉडुलन करने के लिए पर प्रतिक्रिया ,13,14. इसलिए, स्वरित्र यांत्रिक गुणों के साथ बहुलक के सेल संस्कृति अनुप्रयोगों में एक व्यापक रुचि मौजूद है । महत्वपूर्ण बात, सिलिकॉन आधारित elastomers के आंतरिक रूप से कम सतह ऊर्जा eukaryotic कोशिकाओं के सेल संस्कृति के लिए इष्टतम स्थिति प्रदान नहीं करता है । ऑक्सीजन प्लाज्मा उपचार के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया तकनीक PDMS कम सतह ऊर्जा को अस्थाई रूप से बढ़ाने के लिए अग्रणी है, इसके पुल से ताकत की वृद्धि के लिए प्रमुख, अणुओं की सतह सोखना की कमी हुई, जबकि समानांतर में लगाव को बढ़ावा देने, प्रसार और eukaryotic कोशिकाओं के प्रसार15,16,17,18.
सामग्री गुणों के अलावा, सतह स्थलाकृति काफी सेलुलर आसंजन और दो सामग्रियों के बीच चिपकने वाला संपर्क19,20,21,22को प्रभावित करता है । सतह किसी न किसी दो सतहों के बीच संपर्क गठन पर कई प्रभाव पड़ता है: संपर्क क्षेत्र की कमी, उच्च संग्रहीत लोचदार asperities आसपास के रूप में के रूप में अच्छी तरह से दरार प्रचार पर प्रभाव चिपकने वाला शक्ति23बदल सकते है ऊर्जा, 24. मानव त्वचा के लिए स्वयं चिपकने वाली फिल्मों के आसंजन एक उभरते आवेदन क्षेत्र है, जैसे, घाव ड्रेसिंग, ईसीजी इलेक्ट्रोड या अन्य पहनने योग्य इलेक्ट्रॉनिक उपकरणों के निर्धारण25,26,27, २८. स्थलाकृति सतह के संबंध में स्वयं चिपकने वाले प्रदर्शन को मापने के लिए, किसी न किसी की डिग्री बदलती के साथ कांच सब्सट्रेट सामान्य आसंजन माप में इस्तेमाल किया जा सकता8,21. यहां, बहुलक फिल्मों के चिपकने वाले गुणों की जांच करने के लिए दो गिलास सब्सट्रेट चुना गया है । सबसे पहले, 10 से 1 वजन विभिंन मिश्रण अनुपात के साथ PDMS द्वारा कवर भागों की एक मिश्रण अनुपात में एक PDMS समर्थन परत के साथ समग्र फिल्मों विशेषता थे । एक दूसरे चरण में एक चिपकने वाला SSA परत दोनों घटकों के बराबर वजन मात्रा के साथ और एक सहायक PDMS फिल्म के शीर्ष पर अलग फिल्म मोटाई के साथ तैयार किया गया था ।
कंपोजिट संरचनाओं के डिजाइन सामग्री संपत्तियों के सरल समायोजन, जैसे युवा मापांक या नमूनों की मोटाई के रूप में सक्षम बनाता है । PDMS के युवा मापांक प्रभावी रूप से या तो दो घटकों या मिश्रणों के निर्माण के बीच मिश्रण अनुपात फेरबदल द्वारा एक विस्तृत श्रृंखला में बदल सकता है एक अलग सिलिकॉन elastomer30,31का उपयोग कर सकते हैं । वर्णित विधियों PDMS वर्तमान जांच में उपयोग करने के लिए सीमित नहीं हैं, लेकिन विशेष रूप से चिपकने वाला प्रदर्शन उपयोग विशेष प्रकार पर दृढ़ता से निर्भर करता है । इस प्रोटोकॉल के भीतर एक महत्वपूर्ण कदम कंपोजिट फिल्मों (चित्रा 1) के निर्माण की प्रक्रिया है । इसमें दिखाया गया कि फिल्मों की मोटाई काफी हद तक विभिन्ना सब्सट्रेटों पर फिल्मों के आसंजन व्यवहार को प्रभावित करती है, जिसमें त्वचा (चित्रा ५ और चित्रा ६) शामिल हैं. फिल्म मोटाई, इलाज प्रक्रिया के दौरान समय और तापमान के अलावा सामग्री गुण३२को प्रभावित करता है । इसलिए, बहुलक परतों की मोटाई के रूप में मापदंडों को ध्यान से अनुकूलित और सत्यापित किया जाना है ।
पतली फिल्मों के चिपकने वाले गुणों का विश्लेषण सामान्य बल आसंजन के साथ प्रदर्शन किया गया था के साथ दो गिलास सब्सट्रेट का उपयोग कर अलग सतह किसी न किसी को रा अप करने के लिए = ०.३३८ µm (चित्रा 3). सामान्य तौर पर, विशेष रूप से लोचदार सामग्री३३,३४की सतहों के आसंजन, काफी हद तक प्रभावों । कांच की असहजता आसानी से अलग asperity आकार के सैड के साथ पीस द्वारा विविध किया जा सकता है, इसलिए उच्च किसी न किसी मान21प्रदर्शन सब्सट्रेट के निर्माण की अनुमति. इसके अलावा, अंय सामग्री, उदाहरण के लिए epoxy राल सब्सट्रेट के उत्पादन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है15,३५। यह प्रस्तुत प्रोटोकॉल की एक महत्वपूर्ण संशोधन रणनीति हो सकती है । उदाहरण के लिए, यदि विभिंन सतह मुक्त ऊर्जा का प्रदर्शन सब्सट्रेट आवश्यक है या विशिष्ट स्थलाकृति की आवश्यकता है । यहां, पुल बंद तनाव और पतली PDMS और एसएसए से निर्मित फिल्मों की जुदाई का काम एक कस्टम निर्मित सेटअप (macroscopic आसंजन माप उपकरण (पागल, चित्रा 4) के साथ विश्लेषण किया गया । ३६ सब्सट्रेट और फ्रॉम के ऑप्टिकल संरेखण माप परिणामों के विश्लेषण के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है. इसलिए, झुकाव कोण के समायोजन के लिए goniometer के साथ प्रदर्शन की जरूरत है, के रूप में संभव के रूप में सटीक । यह मैन्युअल रूप से एक क्षैतिज संपर्क हासिल की है जब तक फिल्म सतह के साथ संपर्क में सब्सट्रेट लाने के द्वारा पर्याप्त परिशुद्धता के साथ प्राप्त किया जा सकता है.
वर्तमान प्रोटोकॉल में पकड़ समय एक सेकंड में लगातार रखा गया था (5 चित्रा और चित्रा 7) । विशेष रूप से एक मोटा सब्सट्रेट सतह के लिए एक लोचदार फिल्म के चिपकने वाला प्रदर्शन की जांच के लिए, पकड़ समय का विस्तार अतिरिक्त जानकारी प्रदान करता है । उदाहरण के लिए, बढ़ती पकड़ समय के साथ पुल बंद तनाव में वृद्धि8बताया गया है । वर्तमान प्रोटोकॉल में प्रदर्शन किया माप के अलावा, अंय तरीकों, उदाहरण के लिए छील परीक्षण किया जा सकता है, आसंजन प्रदर्शन३७की एक और अधिक व्यापक जांच की अनुमति ।
कोमल त्वचा चिपकने वाली विभिंन फिल्म मोटाई का प्रदर्शन समग्र फिल्मों के चिपकने वाला गुण निर्धारित किया गया (चित्रा 7) । हमारे परिणाम प्रकाशित आंकड़ों के साथ लाइन में हैं, दिखा रहा है कि फिल्म मोटाई की कमी के लिए एक पुल के रूप में तनाव से वृद्धि के रूप में, अर्थात्, सब्सट्रेट व्यास और फिल्म मोटाई के बीच अनुपात, बढ़ जाती है३८,३९ . इन परिणामों और आंकड़ा 7में चित्रित आंकड़ों के आधार पर, हम लगभग की कुल मोटाई के साथ कि समग्र फिल्मों को समाप्त १०० µm (लगभग ६० µm की SSA परत की एक मोटाई लगभग ४० µm की मोटाई के साथ एक PDMS फिल्म के लिए लागू) प्रदर्शन अनुकूल आसंजन p किसी न किसी सतहों पर roperties ।
अगले, जैविक लक्षण वर्णन से संबंधित प्रयोगों प्राचीन समग्र फिल्मों और प्लाज्मा मिश्रित फिल्मों (8 चित्रा) इलाज पर प्रदर्शन किया गया है । सिलिकॉन elastomers के प्लाज्मा उपचार एक अक्सर लागू, बहुमुखी तकनीक सतहों के हाइड्रोफिलिक गुण बढ़ाने के लिए और सेलुलर लगाव और सेलुलर४०,४१प्रसार को बढ़ावा देने है । सिलिकॉन अच्छी तरह से उनके कम विषाक्तता और उच्च के लिए जाना जाता है, लेकिन अवशिष्ट मोनोमर या उत्प्रेरक जो शारीरिक प्रक्रियाओं को प्रभावित हो सकता है, यह भी cytotoxicity४२,४३करने के लिए अग्रणी होते हैं । आयोजित प्रयोगों में हम से कम 5% cytotoxicity एक संकेतक और एक Trypan नीले अपवर्जन परख के रूप में LDH रिहाई का उपयोग कर मनाया है । प्रस्तुत प्रोटोकॉल में, सेलुलर समुच्चय सहित पूरी सेलुलर आबादी, सतह के प्रसार विश्लेषण के लिए विश्लेषण किया गया है (चित्रा 9B) । प्रोटोकॉल का एक संशोधन अधिक विभेदित परिणामों का उत्पादन कर सकता है । प्रत्येक नमूने के लिए, supernatant युक्त सेलुलर समुच्चय एक अलग प्रतिक्रिया ट्यूब करने के लिए स्थानांतरित किया जा सकता है और बहुलक सतह से हटा enzymatically कोशिकाओं के साथ संयुक्त नहीं है । यह सतह से जुड़ी कोशिकाओं के सटीक आकलन की अनुमति है और अंततः सेलुलर आसंजन प्रक्रिया पर पॉलिमर के प्रभाव का एक अधिक विस्तृत निर्धारण प्रकट होता है । immunocytochemical यहां प्रस्तुत तरीकों के अलावा, कोशिकाओं immunoblot तरीकों के साथ जांच के लिए काटा जा सकता है, प्रोटीन अभिव्यक्ति की एक विस्तृत मात्रात्मक मूल्यांकन की अनुमति ।
सारांश में, हम उंनत सेल संस्कृति अनुसंधान में अनुप्रयोगों के लिए पतली elastomeric समग्र फिल्मों के उत्पादन के लिए विनिर्माण शर्तों की स्थापना की है । इसके अतिरिक्त, इन पतली फिल्मों त्वचा किसी न किसी के लिए उच्च अनुकूलन क्षमता के अधिकारी, त्वचा चिपकने के परिष्कृत डिजाइन को सक्षम करने ।
The authors have nothing to disclose.
मार्टिन Danner नमूनों और सेल संस्कृति प्रक्रियाओं की स्थापना की तैयारी में उनकी सहायता के लिए स्वीकार किया है । लेखक Biesterfeld Spezialchemie GmbH (हैंबर्ग, जर्मनी), विशेष रूप से रॉबर्ट Radsziwill सतत समर्थन और विचार विमर्श के लिए शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । इन परिणामों के लिए अग्रणी अनुसंधान यूरोपीय संघ के सातवें फ्रेमवर्क कार्यक्रम (FP/2007-2013)/ERC अनुदान समझौते n. ३४०९२९ के तहत यूरोपीय अनुसंधान परिषद से धन प्राप्त हुआ है ।
2-Propanol, 97% | Stockmeier Chemie | 1000452610000 | Isopropanol |
Abrasive diamnod hand pad | Bohle | MO 5007522 | Grit: 220 |
Accutase | Capricorn Scientific | ACC-1B | |
Albumin Fraktion V | Roth | 0163.2 | BSA |
Alexa Fluor 488 Phalloidin | ThermoFischer Scientific | A12379 | highly toxic |
Aquamount | Polysciences | 18606-20 | water soluble mounting medium |
CytoTox-ONE Homogeneous Membrane Integrity Assay | Promega | G7890 | |
DPBS, without Ca2+, Mg2+ | ThermoFischer Scientific | 14190094 | |
Fetal bovine serum gold | GE Health Care Life Science | A15-151 | FBS |
Goniometer OCA35 | Dataphysics | for the determination of the static water contact angle | |
Hoechst Dye 33342 | Sigma-Aldrich | B1155-100MG | bisBenzimide H 33342 trihydrochloride, highly toxic |
Microscope Axiovert 25 | Zeiss | Microscope used for cell culture documentation | |
Microscope Eclipse LV100ND | Nikon | Microscope used for film thickness determination | |
Paraformaldehyde, aqueous solution 16% | Electron Microscopy Sciences | RT 15710 | electron microscopy grade |
penicillin und streptomycin solution | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | |
Phenom XL Scanning Electron Microscope (SEM) | Phenom | ||
Poly-(vinyl alcohol) 4-88, MW 31000 | Sigma-Aldrich | 81381-1KG | Mowiol 4-88 |
Poly-dimethyl siloxanes, Sylgard 184 | Dow Corning | (400)000108351397 | PDMS |
RPMI 1640 basal medium | ThermoFischer Scientific | 21875034 | |
soft skin adhesive (SSA) | Dow Corning | (400)000108251792 | MG 7-9800 Soft Skin Adhesive (SSA) |
speed mixer DAC 600.2 VAC-P | Hauschild | ||
stylus profilomter | Zeiss | Model: SURFCOM 1500SD3 | |
Tecan Infinite M200 pro | Tecan | fluorescence plate reader | |
Triton X 100 | Calbiochem | 648466 | |
Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | T8154-100ML | highly toxic |
Trypsin/EDTA solution | PAN-Biotech | P10-023500 | 0.05% Trypsin, 0.02% EDTA in PBS |
UV glue | Bohle | BO MV76002 | medium viscosity |