Ett protokoll för tillverkningsprocessen av Polymera tunn film sammansatta strukturer som har antingen olika Youngs moduli eller tjocklekar presenteras. Filmerna produceras för avancerade cellkulturstudier eller som huden bindemedel.
I detta protokoll presenterar vi metoder för att tillverka tunna elastomer sammansatta filmer för avancerad cell kultur tillämpningar och för utvecklingen av huden lim. Två olika poly-(dimethyl siloxanes) (PDMS och mjuk hudlim (SSA)), har använts för djup undersökning av biologiska effekter och självhäftande egenskaper. De sammansatta filmerna består av ett flexibelt stöd lager och en topp limbeläggning. Båda lagren har tillverkats av läkare blade ansökan teknik. I den nuvarande undersökningen, har självhäftande beteendet hos de sammansatta filmerna undersökts som en funktion av lagrartjockleken eller en variant av de Youngs modulus av det översta lagret. De Youngs modulus av PDMS har ändrats genom att variera basen till crosslinker blandningsförhållandet. Dessutom, tjockleken på SSA filmer har varit varierat från ca 16 µm till ca 320 µm. Scanning electron microscopy (SEM) och optisk mikroskopi har använts för tjocklek mätningar. De vidhäftande egenskaperna av elastomer filmer är starkt beroende av filmtjockleken, den Youngs modul av polymerer och ytegenskaper. Normala vidhäftning av dessa filmer på glas substrat uppvisar jämna och ojämna ytor har därför undersökts. Pull-off stress och arbete av separation är beroende av blandande förhållandet av silikonelastomerer.
Dessutom har tjockleken på mjuk hud limmet placerad ovanpå ett stödjande underlag lager varierats för att producera patchar för hud applikationer. Cytotoxicitet, spridning och cellulär adhesion av L929 murina fibroblaster på PDMS filmer (blandningsförhållande 10:1) och SSA filmer (blandning förhållandet 50: 50) har genomförts. Vi har visat här, för första gången, sida vid sida jämförelse av sammansatta tunnfilmer tillverkas av båda polymerer och presenterar utredningen av deras biologiska- och självhäftande egenskaper.
I detta protokoll presenteras detaljerade metoder för tillverkning av tunna elastomer filmer. Allmänt tillgänglig läkare blade tekniken har använts för framställning av tunna sammansatta filmer. Tillverkningstekniken har utförts på polyethylenterephtalate (PET) omkullkastar, möjliggör tillverkning av dessa filmer i stor skala. Betoningen av detta protokoll är bedömningen av reproducerbarhet, exakt tillverkning av de olika lagren av de sammansatta filmerna och bestämning av de biologiska och vidhäftning slutliga sammansatta plåstret. Av silikon elastomer poly-(dimethylsiloxane) (PDMS) används flitigt i biomedicinsk teknik, inklusive produktion av huden lim, mikrofluidik program och ytterligare forskning fält1,2,3 ,4. En annan underklass av PDMS, så kallade mjuka hud lim (SSAs) har nyligen varit införda, särskilt för mild hud limning och de limning.
Silikon SSAs är vinyl functionalized elastomerer, skiljer sig från liknande polymerer av frånvaron av förstärkning kiseldioxid5. Liknar andra PDMS, SSAS Youngs modul kan anpassas i ett brett spektrum av modulerande cross-linker koncentration eller bota tid6,7,8. Denna förändring i Youngs modulus av silikonelastomerer drabbar de vidhäftande egenskaperna av materialet betydligt och har också djupgående konsekvenser på prokaryota och eukaryota celler odlade på ytan9,10 , 11. på biologiska cellnivå, det visades, att eukaryota celler svarar på signaltransduktion nivå på en modulering av matrix elasticitet eller tjocklek på den ytan9,10,12 ,13,14. Därför finns ett brett intresse för cell kultur tillämpningar av polymerer med avstämbara mekaniska egenskaper. Ännu viktigare, ger den egensäkra låg ytenergi av silikonelastomerer baserat inte optimala förhållanden för cellodling av eukaryota celler. Syre plasmabehandling är en allmänt använd teknik för att öka PDMS låg ytenergi tillfälligt, leder till en förbättring av pull-off styrka, minskade ytan adsorption av molekyler, medan parallellt främja fastsättning, sprida och spridning av eukaryota celler15,16,17,18.
Förutom material egenskaper påverkar ytans topografi avsevärt cellulär adhesion och självhäftande samspelet mellan två material19,20,21,22. Ytjämnhet har flera effekter på kontakt bildandet mellan två ytor: minskning av kontaktytan, hög lagrad elastisk energi kring asperities, liksom påverkan på spricka förökningen kan förändra den adhesive styrka23, 24. Vidhäftning av självhäftande filmer till mänsklig hud är en framväxande programfält, exempelvis sårförband, fixering av EKG-elektroder eller andra bärbara elektroniska enheter25,26,27, 28. För att mäta självhäftande self-lim i förhållande till ytan topografi, kan glas substrat med varierande grad av ojämnhet användas i normala vidhäftning mätningar8,21. Här, har två glas substrat valts att undersöka de vidhäftande egenskaperna av polymer filmerna. Första, sammansatta filmer med ett PDMS backing lager i 10 till 1 vikt delar omfattas av PDMS med olika blandningsförhållande blandande förhållandet karakteriserades. I ett andra steg förbereddes en självhäftande SSA skikt med lika vikt mängder både komponenter och med varierande filmtjocklek ovanpå en stödjande PDMS-film.
Konstruktion av sammansatta strukturer möjliggör enkel justering av materialegenskaper, såsom Youngs modul eller tjockleken på proverna. De Youngs modulus av PDMS kan ändras effektivt i ett brett spektrum av antingen ändra mixningsförhållandet mellan de två komponenterna eller framställning av blandningar som använder en annan silikon elastomer30,31. Metoderna som beskrivs är inte begränsade till PDMS används i den nuvarande undersökningen, men speciellt självhäftande prestanda beror starkt på den specifika typ som används. Ett avgörande steg i detta protokoll är processen för tillverkning av sammansatta filmerna (figur 1). Det visades att tjockleken på filmerna avsevärt påverkar beteendet vidhäftning av filmerna på olika substrat, inklusive hud (figur 5 och figur 6). Förutom filmtjockleken påverkar tid och temperatur under härdningsprocessen de materialegenskaper32. Därför har parametrar som tjockleken på polymera lagren noga anpassas och verifierade.
Analysen av de vidhäftande egenskaperna av tunna filmer utfördes med Normalkraft vidhäftning mätningar med två glas substrat med olika ytjämnhet upp till Ra = 0.338 µm (figur 3). I allmänhet påverkar råhet avsevärt adhesionen av ytor, särskilt av elastiska material33,34. Ojämnheter på glas kan enkelt varieras genom slipning med sandpapper av olika ojämnhetstopparnas storlekar, därför möjliggör tillverkning av substrat som uppvisar högre strävhet värden21. I tillägg, andra material, kan till exempel epoxi användas för produktion av substrat15,35. Detta kan vara en viktig ändring strategi av protokollet presenteras. Till exempel om substrat uppvisar olika fria ytenergier behövs eller specifika krävs kretsmönster. Här, analyserades pull-off stress och arbete av separation av de tunna filmer som tillverkas av PDMS och SSA med en specialbyggd setup (makroskopisk vidhäftning hastighetsmätning enhet (MAD, figur 4)). 36 optisk anpassning av substrat och indenter är ett kritiskt steg för analys av mätresultaten. Justering av lutningsvinkel måste därför utföras med goniometer, så exakt som möjligt. Detta kan uppnås med tillräcklig precision genom att manuellt föra substratet i kontakt med film ytan tills en horisontell kontakt uppnås.
I det nuvarande protokollet hölls håll tiden konstant på en sekund (figur 5 och figur 7). Särskilt för undersökningen av en elastisk film till en yta med grov substrat självhäftande prestanda ger en förlängning av hold ytterligare information. Exempelvis har en pull-off stress med ökande spärrtiden ökat rapporterade8. Förutom de mätningar som utförs i det nuvarande protokollet, andra metoder, till exempel peel tester kan utföras, så att en mer omfattande utredning av vidhäftning prestanda37.
De vidhäftande egenskaperna av sammansatta filmer uppvisar olika film tjocklekar av mjuk hud limmet bestämdes (figur 7). Våra resultat är i linje med publicerade data, som visar att en minskning av film tjocklek leder till en ökning av pull-off stress som förlossningen, dvs, förhållandet mellan substrat diameter och film tjocklek, ökar38,39 . Baserat på dessa resultat och de uppgifter som avbildas i figur 7kan konstatera vi att sammansatta filmer med en sammanlagd tjocklek av ca 100 µm (en tjocklek av SSA lagret av ca 60 µm tillämpas på en PDMS-film med en tjocklek av ca 40 µm) uppvisar god vidhäftning p egenskaper på ojämna ytor.
Nästa, experiment relaterade till biologiska karakterisering har utförts på orörda sammansatta filmer och plasma behandlas sammansatta filmer (figur 8). Plasmabehandling av silikon elastomerer är en ofta tillämpas, mångsidig teknik att öka hydrofila egenskaper hos ytor och främja cellulära fastsättning och cellulära sprida40,41. Silikoner är väl kända för sin låg toxicitet och hög biostability men kan innehålla restmonomerer eller katalysatorer som kan påverka fysiologiska processer, leder också till cytotoxicitet42,43. I den genomförda experiment har vi observerat mindre än 5% cytotoxicitet med LDH release som en indikator och en Trypan blå utslagning assay. I protokollet presenteras, hela cellulära befolkningen, inklusive mobilt aggregat fristående form ytan har analyserats för spridning analys (bild 9B). En ändring av protokollet kunde producera mer differentierade resultat. För varje prov, kunde supernatanten innehållande fristående cellulära aggregat överföras till en separat reaktionsröret och inte kombineras med cellerna enzymatiskt avlägsnas från polymer ytan. Detta skulle tillåta den exakta bedömningen av celler som är kopplade till ytan och så småningom avslöja en närmare bestämning av påverkan av polymerer på cellulär adhesion processen. Utöver immunocytochemical metoder presenteras här, kan celler skördas för utredning med immunoblot metoder, som tillåter en detaljerad kvantitativ bedömning av proteinuttryck.
Sammanfattningsvis har vi etablerat tillverkning villkor för framställning av tunna elastomeriska sammansatta filmer för applikationer inom avancerad cell kulturforskning. Dessa tunna filmer äger dessutom hög anpassningsförmåga till hudens ojämnheter, möjliggör sofistikerad design av huden lim.
The authors have nothing to disclose.
Martin Danner är erkänt för sin hjälp med att förbereda prover och fastställande av cell kultur förfaranden. Författarna vill tacka Biesterfeld Spezialchemie GmbH (Hamburg, Tyskland), särskilt Robert Radsziwill för kontinuerligt stöd och diskussioner. Den forskning som leder till dessa resultat har fått finansiering från Europeiska forskningsrådet under EU: s sjunde ramprogram (FP/2007-2013) ERC bidragsavtalet n. 340929.
2-Propanol, 97% | Stockmeier Chemie | 1000452610000 | Isopropanol |
Abrasive diamnod hand pad | Bohle | MO 5007522 | Grit: 220 |
Accutase | Capricorn Scientific | ACC-1B | |
Albumin Fraktion V | Roth | 0163.2 | BSA |
Alexa Fluor 488 Phalloidin | ThermoFischer Scientific | A12379 | highly toxic |
Aquamount | Polysciences | 18606-20 | water soluble mounting medium |
CytoTox-ONE Homogeneous Membrane Integrity Assay | Promega | G7890 | |
DPBS, without Ca2+, Mg2+ | ThermoFischer Scientific | 14190094 | |
Fetal bovine serum gold | GE Health Care Life Science | A15-151 | FBS |
Goniometer OCA35 | Dataphysics | for the determination of the static water contact angle | |
Hoechst Dye 33342 | Sigma-Aldrich | B1155-100MG | bisBenzimide H 33342 trihydrochloride, highly toxic |
Microscope Axiovert 25 | Zeiss | Microscope used for cell culture documentation | |
Microscope Eclipse LV100ND | Nikon | Microscope used for film thickness determination | |
Paraformaldehyde, aqueous solution 16% | Electron Microscopy Sciences | RT 15710 | electron microscopy grade |
penicillin und streptomycin solution | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | |
Phenom XL Scanning Electron Microscope (SEM) | Phenom | ||
Poly-(vinyl alcohol) 4-88, MW 31000 | Sigma-Aldrich | 81381-1KG | Mowiol 4-88 |
Poly-dimethyl siloxanes, Sylgard 184 | Dow Corning | (400)000108351397 | PDMS |
RPMI 1640 basal medium | ThermoFischer Scientific | 21875034 | |
soft skin adhesive (SSA) | Dow Corning | (400)000108251792 | MG 7-9800 Soft Skin Adhesive (SSA) |
speed mixer DAC 600.2 VAC-P | Hauschild | ||
stylus profilomter | Zeiss | Model: SURFCOM 1500SD3 | |
Tecan Infinite M200 pro | Tecan | fluorescence plate reader | |
Triton X 100 | Calbiochem | 648466 | |
Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | T8154-100ML | highly toxic |
Trypsin/EDTA solution | PAN-Biotech | P10-023500 | 0.05% Trypsin, 0.02% EDTA in PBS |
UV glue | Bohle | BO MV76002 | medium viscosity |