深部真皮注射液作为白色念珠菌皮肤感染模型的组织学分析
Summary
在这里, 我们描述了一个协议, 允许皮肤标本的组织学和分子分析后,白色念珠菌皮注射液。该协议维护皮肤的结构完整性, 并允许组织居民或新招募的免疫细胞的定位以及病原体的分布。
Abstract
皮肤是身体的一个非常扩展的器官, 并且, 由于这个大表面, 它持续暴露于微生物。皮肤损伤很容易导致真皮的感染, 进而导致病原体向血液中传播。了解免疫系统在早期如何对抗感染, 以及宿主如何消除病原体是确定今后治疗干预的基础的重要步骤。在这里, 我们描述了一种白色念珠菌感染模型, 可以可视化的过程中发生的早期感染, 包括当病原体已经通过了上皮屏障, 以及由C. 白念珠菌诱发的免疫反应入侵。我们利用这种感染模型进行组织学分析, 显示了渗透皮肤的免疫细胞以及病原体的存在和定位。在感染后收集的样本可以处理 RNA 提取。
Introduction
人体上覆盖着极高数量的微生物。皮肤表面是大约100万细菌的栖所每平方厘米1。然而, 这个数字并没有反映出殖民皮肤的各种微生物。除了细菌外, 人体还被许多真菌物种所殖民, 包括白色念珠菌, 它能够在粘膜和皮肤2级存活。
近年来, 被诊断为真菌感染的人的百分比大大增加。这主要是由于免疫机能丧失者的数量增加,即HIV 阳性患者和3移植后经过化疗或免疫抑制剂的患者。在美国进行的一项监测研究中, Wisplinghoff等人发现, 9.5% 的医院血流感染是由念珠菌4种引起的。由于真菌感染的增加, 特别是由于血液感染中发现的念珠菌的比例升高, 了解这种病原体如何逃脱免疫系统的控制是非常重要。
白色念珠菌是一种二形真菌, 生长在不同形态形态, 如酵母, blastospores, 假菌丝和菌丝, 取决于环境条件5。在其菌丝的形式,白色念珠菌显示其最高的侵袭能力, 并有能力穿透上皮6。
用几种实验方法对白念珠菌感染进行了研究。最常见的感染模型是静脉注射白色念珠菌酵母7。然而, 这个模型没有考虑到所有的过程中发生的真菌传播到血液中。另一种模型利用C. 白念珠菌侵入上皮细胞的能力。这种方法, 也称为砂纸模型8, 是由 Gaspari等在1998年开发的9, 并包括使用沙纸擦伤皮肤, 从而消除角质层之前, 应用C. 白念珠菌。这个过程允许真菌穿透上皮, 从而能够分析这种病原体的侵袭能力。最后, 其他模型的胃肠道10和呼吸道感染11已被用于不同的研究。
伤口的形成 (如在沙纸模型中) 导致了几个途径的活化, 包括免疫细胞的招募和活化, 以促进愈合过程12。这可以改变或掩盖对病原体特别诱发的免疫反应, 从而导致混淆结果。
在这里, 我们描述一种皮肤感染的方法, 避免最初的伤口形成和诱导的基底炎症环境。为了保持完整的上皮结构, 我们直接在深真皮中注射菌丝形式的白色念珠菌。尽管单个注射可以引起轻度炎症, 但与在沙纸模型中的开放性伤口的形成相比, 炎症的数量受到限制和限制。我们在这里描述的方法允许研究真菌感染和传播的免疫反应, 同时避免机械损伤造成的过度和预先存在的炎症环境。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这里, 我们描述了一种C. 白念珠菌感染的方法, 以研究在深层真皮真菌入口引发的炎症过程。
虽然皮肤脓肿的形成是一个相对罕见的事件后, C. 白色念珠菌感染15, 直接在深真皮中注射真菌不仅可以研究真菌驱动脓肿的形成, 而且还分析特异免疫参与控制真菌扩散的细胞。在这里描述的方法, 可以研究免疫细胞之间的相互作用, 以及免疫细胞的招?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Associazione 意大利每 la Ricerca Cancro (2016 号 18842), Cariplo 基金会 (赠款 2014-0655), 乔瓦尼博物馆每 la Ricerca 牛津 (FRRB) 支持。
伊兹获得 NIH 赠款 1R01AI121066-01A1, 1R01DK115217, HDDC P30 DK034854 补助金, 哈佛医学院弥尔顿发现, CCFA 高级研究奖 (412708), 埃莉诺和迈尔斯海岸第五十周年奖学金计划, Cariplo 基金会 (2014-0859)。
Materials
| Reagents | |||
| PBS | Euroclone | ECB4053L | warm in 37 °C bath before use |
| H-OCT compound | histo-line laboratories | R0030 | |
| Gill's Hematoxilyn | histo-line laboratories | 09-178-2 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | histo-line laboratories | 09-209-05 | |
| Ethanol absolute | scharlau | ET00232500 | |
| Citro-HISTOCLEAR | histo-line laboratories | R0050 | |
| Eukitt, mounting medium | bio-optica | ||
| Acetone | sigma-aldrich | 179124 | |
| PAS staining system | sigma-aldrich | 395B-1KT | |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| Bacto Yeast Extract | BD | 212750 | |
| D(+)-Glucose anhydrous for molecular biology | Applichem PanReac | 50-99-7 | |
| Uridine | Merck Millipore | 8451 | |
| HEPES | Applichem PanReac | A1070,0500 | |
| Safe-Lock tubes 2 mL | eppendorf | 30121597 | |
| TRIzol Reagent | Life Technologies | 15596018 | Toxic, corrosive and mutagen. Use all precaution needed |
| Rneasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | |
| liquid nitrogen | Wear eye protection | ||
| Instrument | |||
| Coulter Counter-Particle Count | Beckman Coulter | ||
| Centrifuge 5415 R | eppendorf | ||
| MC 3000 Microtome Cryostat | histo-line laboratories | ||
| TissueLiser | QIAGEN | ||
| Materials | |||
| 0.3 ml Insulin Syringe with a 30G x 8mm needle | BD | 324826 | |
| Surgical forceps | |||
| Surgical scissors | |||
| Base mould disposable | histo-line laboratories | 2781 | |
| Positively charged bio microscope slides | bio-optica | 09-2000 | |
| Cover slips 24 x 50 mm | thermo scientific | 11911998 |
References
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