Dyb Dermal injektion som en Model af Candida albicans hudinfektion histologisk analyser

Summary

Her beskriver vi en protokol, der giver mulighed for histologiske og molekylær analyse af hud prøver efter Candida albicans intradermal injektion. Denne protokol fastholder den strukturelle integritet af huden og giver mulighed for lokalisering af væv-resident eller nyligt rekrutterede immunceller samt patogen distribution.

Abstract

Huden er ekstremt forlængede organ i kroppen, og på grund af denne store overflade, er det konstant udsat for mikroorganismer. Skader i huden kan let føre til infektioner i dermis, som kan, til gengæld medføre spredning af patogener i blodbanen. Forstå hvordan immunsystemet bekæmper infektioner i den meget tidlige fase og hvordan værten kan fjerne patogener er et vigtigt skridt til at indstille basen for fremtidige terapeutiske indgreb. Her beskriver vi en model af Candida albicans infektion, der kan visualisere de processer, der opstår tidligt under en infektion, herunder når patogenet har bestået den epitel barriere, samt den immunrespons, som fremkaldes ved C. albicans invasion. Vi der denne infektion model udfører histologiske analyser, der viser de immunceller, der infiltrere huden samt tilstedeværelse og lokalisering af patogenet. Prøver indsamles efter infektionen kan behandles for RNA udvinding.

Introduction

Den menneskelige krop er dækket med et meget højt antal mikroorganismer. Hudens overflade er levested for næsten en million bakterier pr. kvadratcentimeter¹. Dette tal afspejler dog ikke den fulde række mikroorganismer, der koloniserer huden. Ud over bakterier, er den menneskelige krop koloniseret af mange svampe arter, herunder C. albicans, som er i stand til at overleve både på den slimhinde og hud niveau².

Procentdelen af mennesker diagnosticeret med svampeinfektioner steget enormt i de seneste år. Dette skyldes især det højere antal immunsvækkede personer, dvs., HIV-positive patienter og patienter, der har været igennem kemoterapi eller immunosuppressive lægemidler efter transplantation³. I en overvågning undersøgelse udført i USA, viste Wisplinghoff et al. , 9,5% af nosokomielle blodbanen infektioner skyldes Candida arter⁴. På grund af øget forekomst af svampeinfektioner og især på grund af den forhøjede procentdel af Candida arter fundet under blodforgiftning, er forstå, hvordan dette patogen undslipper kontrol af immunsystemet yderst vigtigt.

C. albicans er en Dimorfe svampe, der vokser i forskellige morfologiske former, såsom gær, blastospores, pseudohyphae og hyfer afhængigt af de miljømæssige forhold⁵. I sin hyphal form, C. albicans viser sin højeste invasionsevne kapacitet og har evnen til at trænge epitel⁶.

C. albicans infektioner er blevet studeret ved hjælp af flere eksperimentelle metoder. Den mest almindelige model for infektion er intravenøs injektion af C. albicans gær⁷. Dog tager denne model ikke hensyn til alle processer der ske før svampen formår at sprede sig til blodbanen. En anden model tager fordel af C. albicans evne til at invadere epitel. Denne metode, også kendt som sand papir model⁸, blev udviklet af Gaspari et al. i 1998⁹, og består af at bruge sandpapir til slib huden, hvilket eliminerer stratum corneum før du anvender C. albicans. Denne fremgangsmåde gør det muligt for svampen at trænge epitel, således at analysen af de invasive evner af dette patogen. Endelig, andre modeller af infektioner for gastrointestinale¹⁰ og luftveje¹¹ har været brugt i forskellige undersøgelser.

Dannelsen af et sår (som i sand papirmodellen) medfører aktivering af flere veje, herunder immun celle rekruttering og aktivering, for at fremme den helbredende proces¹². Dette kan enten ændre eller maskere immunresponset specifikt fremkaldte mod patogenet, hvilket fører til confounding resultater.

Her beskriver vi en metode af hudinfektion, der undgår første sår dannelse og induktion af en basal inflammatoriske miljø. For at bevare den intakt epitelial struktur, injicere vi direkte C. albicans i sin hyphal form i de dybe derma. Selv om en enkelt injektion kan fremkalde mild betændelse, mængden af betændelse er begrænset og begrænsede i forhold til dannelsen af et åbent sår i sand papirmodellen. Den tilgang, som vi beskriver her giver mulighed for undersøgelse af immunresponset svampeinfektion og udbredelsen samtidig undgå overdreven og allerede eksisterende inflammatoriske miljøet forårsaget af mekaniske skader.

Protocol

Alle procedurerne, der blev godkendt under den institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) og drives under tilsyn af department of Animal ressourcer på børn ‘s Hospital (SVANGEN) på Boston children’s Hospital eller blev godkendt af italienske Ministeriet for sundhed og udføres i henhold til Udvalget om institutionelle Animal Care på Universitet i Milano-Bicocca. 1. C. albicans forberedelse Kultur C. albicans, stamme CAF3-113, i r?…

Representative Results

Ved injektion af patogenet direkte i den dybe derma forbliver strukturelle morfologi af væv intakt (figur 1A). Vedligeholdelse af hudens strukturelle integritet giver mulighed for påvisning af immunceller og deres lokalisering på webstedet af infektion. Højere forstørrelse vist i figur 1B viser, at bylden hovedsageligt består af polymorfnukleære leukocytter (PMCs…

Discussion

Her beskrevet vi en metode af C. albicans infektion at studere den inflammatoriske proces, der er indledt efter svampe indgang i den dybe derma.

Selvom hud absces dannelse er en forholdsvis sjælden begivenhed ved C. albicans infektion¹⁵, injektion af svampen direkte i den dybe derma giver mulighed for undersøgelse af svampe-drevet absces dannelse, men også analyse af specifik immun celler, der deltager for at indeholde svampe spredes. Med metoden be…

Materials

Reagents
PBS	Euroclone	ECB4053L	warm in 37 °C bath before use
H-OCT compound	histo-line laboratories	R0030
Gill's Hematoxilyn	histo-line laboratories	09-178-2
Eosin Y solution, alcoholic	histo-line laboratories	09-209-05
Ethanol absolute	scharlau	ET00232500
Citro-HISTOCLEAR	histo-line laboratories	R0050
Eukitt, mounting medium	bio-optica
Acetone	sigma-aldrich	179124
PAS staining system	sigma-aldrich	395B-1KT
Bacto Peptone	BD	211677
Bacto Yeast Extract	BD	212750
D(+)-Glucose anhydrous for molecular biology	Applichem PanReac	50-99-7
Uridine	Merck Millipore	8451
HEPES	Applichem PanReac	A1070,0500
Safe-Lock tubes 2 mL	eppendorf	30121597
TRIzol Reagent	Life Technologies	15596018	Toxic, corrosive and mutagen. Use all precaution needed
Rneasy Mini Kit	QIAGEN	74104
liquid nitrogen			Wear eye protection
Instrument
Coulter Counter-Particle Count	Beckman Coulter
Centrifuge 5415 R	eppendorf
MC 3000 Microtome Cryostat	histo-line laboratories
TissueLiser	QIAGEN
Materials
0.3 ml Insulin Syringe with a 30G x 8mm needle	BD	324826
Surgical forceps
Surgical scissors
Base mould disposable	histo-line laboratories	2781
Positively charged bio microscope slides	bio-optica	09-2000
Cover slips 24 x 50 mm	thermo scientific	11911998