עמוק עורי הזרקת כמו מודל של קנדידה אלביקנס דלקת עור עבור ניתוחים היסטולוגית

Summary

כאן נתאר פרוטוקול המאפשר ניתוח היסטולוגית ומולקולרית של דגימות עור לאחר ההזרקה intradermal קנדידה אלביקנס . פרוטוקול זה שומר על שלמות המבנה של העור ומאפשר הלוקליזציה של תאים חיסוניים רקמות-תושב או שזה עתה מגויסים, כמו גם את ההתפלגות הפתוגן.

Abstract

העור הוא איבר מאוד מורחבת של הגוף, עקב זה משטח גדול, ללא הרף ייחשף מיקרואורגניזמים. נזק לעור יכול בקלות להוביל דלקות הדרמיס והתוצאה בתורו, יכול, להיות הפצת פתוגנים למחזור הדם. הבנת איך מערכת החיסון נלחם זיהומים בשלב מוקדם מאוד, איך המחשב המארח יכול לחסל פתוגנים היא צעד חשוב כדי להגדיר את הבסיס עבור התערבויות טיפוליות עתידיות. כאן נתאר מודל של זיהום קנדידה אלביקנס שיכולים להמחיש את התהליכים המתרחשים מוקדם במהלך זיהום, כולל בעת המחלה עברה את מחסום האפיתל, כמו גם את התגובה החיסונית שהפיק את אלביקנס ג הפלישה. השתמשנו מודל זיהום זה כדי לבצע ניתוח היסטולוגית המציגים את התאים החיסוניים זה לחדור את העור, כמו גם את הנוכחות ואת לוקליזציה של המחלה. הדגימות שנאספו לאחר הזיהום ניתן לעבד לחילוץ RNA.

Introduction

גוף האדם מכוסה עם מספר גבוה מאוד של מיקרואורגניזמים. לפני השטח של העור הוא בית הגידול של כמעט מיליון חיידקים לכל סנטימטר מרובע¹. מספר זה, עם זאת, אינו משקף על המגוון המלא של מיקרואורגניזמים והצנרות העור. בנוסף חיידקים, גוף האדם הוא התנחלו על ידי מינים פטרייתי רבים, כולל אלביקנס ג, שזה מסוגל לשרוד הן את הרירית והן את העור ברמה².

בשנים האחרונות גדל מאוד האחוז של אנשים שאובחנו עם זיהומים פטרייתיים. זאת בעיקר בשל העלייה במספר אנשים immunocompromised, קרי, חולי HIV-חיובי. וכלפי מטופלים עברו כימותרפיה או תרופות לדיכוי המערכת החיסונית לאחר השתלת³. במחקר מעקב שנערך בארצות הברית, Wisplinghoff. et al. הראה כי 9.5% של זיהומים nosocomial למחזור הדם שנגרמו על ידי זנים של קנדידה ⁴. עקב המופע מוגברת של זיהומים פטרייתיים, במיוחד בגלל האחוז מוגברות של קנדידה מינים נמצאו במהלך זיהומים למחזור הדם, הבנת איך הפתוגן הזה בורח השליטה של מערכת החיסון היא מאוד חשוב.

ג אלביקנס הוא בפטריה dimorphic שגדלה בצורות מורפולוגיות שונות כגון שמרים, blastospores, pseudohyphae ו- hyphae בהתאם לתנאים סביבתיים⁵. בצורתו hyphal, אלביקנס ג מציג את הקיבולת הגבוהה שלו invasiveness ויש לו את היכולת לחדור את אפיתל⁶.

זיהומים אלביקנס ג נחקרו באמצעות מספר גישות ניסיוניות. המודל הנפוץ ביותר של זיהום הוא הזרקה תוך ורידי של שמרים אלביקנס ג ⁷. עם זאת, מודל זה לא להתחשב בכל התהליכים זה יקרה לפני הפטריה מצליח להתפשט למחזור הדם. מודל נוסף מנצל היכולת של אלביקנס ג לפלוש האפיתל. בשיטה זו, המכונה גם נייר דגם⁸, פותחה על ידי Gaspari et al. . ב 1998⁹, מורכב באמצעות נייר חול כדי תשפשפו את העור, וכך למנוע את הקרנית לפני החלת אלביקנס ג. הליך זה מאפשר את הפטרייה לחדור האפיתל, ובכך מאפשר ניתוח פולשני ביכולות של הפתוגן הזה. לבסוף, דגמים אחרים של זיהומים במערכת העיכול¹⁰ ו כלי הנשימה¹¹ השתמשו במחקרים שונים.

היווצרות פצע (כמו דגם נייר חול) גורמת את ההפעלה של כמה מסלולים, כולל תא החיסון גיוס והפעלה, על מנת לקדם את תהליך הריפוי¹². זה יכול לשנות או להסתיר את התגובה החיסונית במיוחד elicited נגד המחלה, ובכך מוביל משתנה מתערב תוצאות.

כאן נתאר שיטת דלקת עור זה מונע היווצרות פצע הראשונית ואת של אינדוקציה של סביבה דלקתית הבזליים. כדי לשמור על המבנה אפיתל ללא פגע, ישירות נזריק אלביקנס ג בצורתה hyphal ב למחרת היום עמוק. אף-על-פי זריקה אחת יכול להפיק דלקת קלה, הכמות של דלקת מוגבלת, מוגבל לעומת היווצרות פצע פתוח כמו דגם נייר חול. הגישה כי אנו מתארים כאן מאפשר המחקר של התגובה החיסונית לזיהום פטרייתי, התפשטה תוך הימנעות הסביבה דלקתית מוגזמת ולא קיימים נגרם נזק מכני.

Protocol

כל ההליכים היו מאושרים תחת טיפול בעלי חיים מוסדיים ו שימוש הוועדה (IACUC) ולא פעלו תחת פיקוחו של המחלקה של משאבים בעלי חיים לילדים חולים (קשת) בבית החולים לילדים בבוסטון או אושרו על-ידי האיטלקי משרד הבריאות והופיע תחת מוסדיים חיה טיפול הוועדה ב האוניברסיטה של מילאנו-ביקוקה. 1. הכ?…

Representative Results

באמצעות ההזרקה של המחלה ישירות בלמחרת היום עמוק, המורפולוגיה מבנית של רקמת נשאר שלם (איור 1 א’). שמירה על העור המבנית מאפשרת הגילוי של תאים חיסוניים ולוקליזציה שלהם באתר של זיהום. ההגדלה גבוה יותר באיור איור 1B</stro…

Discussion

כאן אנחנו תיאר שיטה של זיהום אלביקנס ג ללמוד תהליך דלקתי שמאותחלת הכניסה פטרייתי ב למחרת היום עמוק.

אף-על-פי להצטברות של העור הוא אירוע נדיר יחסית על זיהום אלביקנס ג ¹⁵, הזרקה של הפטרייה ישירות בלמחרת היום עמוק מאפשר לא רק חקר היווצרות מורסה מונחה-פטריי?…

Materials

Reagents
PBS	Euroclone	ECB4053L	warm in 37 °C bath before use
H-OCT compound	histo-line laboratories	R0030
Gill's Hematoxilyn	histo-line laboratories	09-178-2
Eosin Y solution, alcoholic	histo-line laboratories	09-209-05
Ethanol absolute	scharlau	ET00232500
Citro-HISTOCLEAR	histo-line laboratories	R0050
Eukitt, mounting medium	bio-optica
Acetone	sigma-aldrich	179124
PAS staining system	sigma-aldrich	395B-1KT
Bacto Peptone	BD	211677
Bacto Yeast Extract	BD	212750
D(+)-Glucose anhydrous for molecular biology	Applichem PanReac	50-99-7
Uridine	Merck Millipore	8451
HEPES	Applichem PanReac	A1070,0500
Safe-Lock tubes 2 mL	eppendorf	30121597
TRIzol Reagent	Life Technologies	15596018	Toxic, corrosive and mutagen. Use all precaution needed
Rneasy Mini Kit	QIAGEN	74104
liquid nitrogen			Wear eye protection
Instrument
Coulter Counter-Particle Count	Beckman Coulter
Centrifuge 5415 R	eppendorf
MC 3000 Microtome Cryostat	histo-line laboratories
TissueLiser	QIAGEN
Materials
0.3 ml Insulin Syringe with a 30G x 8mm needle	BD	324826
Surgical forceps
Surgical scissors
Base mould disposable	histo-line laboratories	2781
Positively charged bio microscope slides	bio-optica	09-2000
Cover slips 24 x 50 mm	thermo scientific	11911998