Глубокий дермальный инъекции как модель кожи инфекции Candida albicans для гистологического анализа
Summary
Здесь мы описываем протокол, который позволяет гистологические и молекулярный анализ образцов кожи после Candida albicans внутрикожные инъекции. Этот протокол поддерживает структурную целостность кожи и позволяет для локализации ткани резидентом или вновь набранных иммунных клеток, а также распространение возбудителя.
Abstract
Кожа является чрезвычайно длительного органом тела, и, благодаря этой большой поверхности, постоянно подвергается воздействию микроорганизмов. Повреждения кожи может легко привести к инфекции в дерме, которая может в свою очередь, привести к распространению патогенов в кровоток. Понимание как иммунная система борется инфекции на самом раннем этапе и как хост может устранить патогены является важным шагом для задания базы для будущих терапевтических вмешательств. Здесь мы описываем модель инфекции Candida albicans , которая может визуализировать процессы, которые происходят в начале во время инфекции, включая когда возбудитель прошел эпителиальных барьер, а также вызвал C. albicans иммунного ответа вторжения. Мы использовали модель этой инфекции для выполнения гистологические анализы, которые показывают иммунные клетки, которые проникнуть в кожу, а также присутствие и локализации возбудителя. Отбор проб после инфекции могут быть обработаны для извлечение RNA.
Introduction
Человеческое тело покрыто чрезвычайно большое количество микроорганизмов. Поверхность кожи обитает почти один миллион бактерий на1квадратный сантиметр. Это число, однако, не отражает полное разнообразие микроорганизмов, что колонизирует кожи. В дополнение к бактерии человеческое тело колонизирована многих грибковых видов, включая C. albicans, которая способна выжить на слизистых оболочек и кожи уровня2.
В последние годы доля людей с диагнозом грибковые инфекции значительно увеличилась. Это объясняется главным образом большее количество лиц с ослабленным иммунитетом, т.е., ВИЧ позитивных пациентов и пациентов, которые прошли через химиотерапии или иммуносупрессивных препаратов после трансплантации3. В наблюдения исследования, проведенного в Соединенных Штатах Америки Висплингхофф et al. показал, что 9,5% от внутрибольничных инфекций кровотока были вызваны Candida видов4. Из-за увеличения возникновения грибковых инфекций и особенно из-за повышенных процент видов Candida , найден во время инфекций кровотока понимание того, как этот возбудитель ускользает от контроля иммунной системы является чрезвычайно важное значение.
C. albicans является диморфных грибов, которые растут в различных морфологических форм, таких как дрожжи, blastospores, pseudohyphae и ГИФы в зависимости от условий окружающей среды5. В виде гиф C. albicans показывает свой высокий потенциал инвазии и имеет способность проникать в эпителии6.
C. albicans инфекции были изучены с использованием нескольких экспериментальных подходов. Наиболее распространенная модель инфекции является внутривенным введением C. albicans дрожжи7. Однако эта модель не принимать во внимание все процессы, произойдет перед гриб успевает распространяться в кровоток. Другая модель использует C. albicans возможность вторгнуться в эпителии. Этот метод, также известный как наждачная бумага модель8, был разработан Гаспари et al. 19989и состоит в использовании наждачной бумагой, чтобы стирать кожу, тем самым устраняя рогового слоя перед нанесением C. albicans. Эта процедура позволяет гриб проникнуть эпителия, таким образом позволяя анализ инвазивных способностей данного патогена. Наконец другие модели инфекций желудочно-кишечного тракта10 и11 дыхательных путей были использованы в различных исследованиях.
Формирование раны (как наждачная бумага модель) приводит к активации несколько путей, включая набор иммунных клеток и активации, с тем чтобы содействовать исцеления процесса12. Это можно изменить или замаскировать иммунный ответ, специально вызвало против возбудителя, что приводит к смешанным результатам.
Здесь мы описываем метод инфекции кожи, что позволяет избежать формирования первоначальной раны и индукции базальной воспалительных окружающей среды. Чтобы сохранить нетронутыми эпителиальные структуры, мы напрямую впрыскивают C. albicans в виде гиф в глубокой дермы. Даже несмотря на то, что одной инъекции может вызывать воспаление мягкой, количество воспаления ограничена и ограничены по сравнению с формирования открытой раной как наждачная бумага модели. Подход, который мы здесь описывать позволяет изучение иммунного ответа на грибковой инфекции и распространение, избегая чрезмерного и существующие воспалительных среды, вызванных механического повреждения.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы описали метод C. albicans инфекции для изучения воспалительный процесс, который инициируется при грибковых вход в глубокой дермы.
Несмотря на то, что формирование абсцесса кожи является относительно редким явлением на C. albicans инфекции15, инъекци…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
FG поддерживается Associazione Italiana за Ла Ricerca Сул Cancro (IG 2016Id.18842), Фонд Cariplo (грант 2014-0655) и Fondazione Regionale за Ла Ricerca лактулоза (НСФО).
IZ поддерживается NIH Грант 1R01AI121066-01A1, 1R01DK115217, HDDC Р30 DK034854 Грант, Гарвардской медицинской школы Милтон нашли, CCFA старший исследования награды (412708), Элеонора и миль берега 50-й годовщины программы стипендий и Фонд Cariplo ( 2014-0859).
Materials
| Reagents | |||
| PBS | Euroclone | ECB4053L | warm in 37 °C bath before use |
| H-OCT compound | histo-line laboratories | R0030 | |
| Gill's Hematoxilyn | histo-line laboratories | 09-178-2 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | histo-line laboratories | 09-209-05 | |
| Ethanol absolute | scharlau | ET00232500 | |
| Citro-HISTOCLEAR | histo-line laboratories | R0050 | |
| Eukitt, mounting medium | bio-optica | ||
| Acetone | sigma-aldrich | 179124 | |
| PAS staining system | sigma-aldrich | 395B-1KT | |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| Bacto Yeast Extract | BD | 212750 | |
| D(+)-Glucose anhydrous for molecular biology | Applichem PanReac | 50-99-7 | |
| Uridine | Merck Millipore | 8451 | |
| HEPES | Applichem PanReac | A1070,0500 | |
| Safe-Lock tubes 2 mL | eppendorf | 30121597 | |
| TRIzol Reagent | Life Technologies | 15596018 | Toxic, corrosive and mutagen. Use all precaution needed |
| Rneasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | |
| liquid nitrogen | Wear eye protection | ||
| Instrument | |||
| Coulter Counter-Particle Count | Beckman Coulter | ||
| Centrifuge 5415 R | eppendorf | ||
| MC 3000 Microtome Cryostat | histo-line laboratories | ||
| TissueLiser | QIAGEN | ||
| Materials | |||
| 0.3 ml Insulin Syringe with a 30G x 8mm needle | BD | 324826 | |
| Surgical forceps | |||
| Surgical scissors | |||
| Base mould disposable | histo-line laboratories | 2781 | |
| Positively charged bio microscope slides | bio-optica | 09-2000 | |
| Cover slips 24 x 50 mm | thermo scientific | 11911998 |
References
- Belkaid, Y., Segre, J. A. Dialogue between skin microbiota and immunity. Science. 346 (6212), 954-959 (2014).
- Kashem, S. W., Kaplan, D. H. Skin Immunity to Candida albicans. Trends Immunol. 37 (7), 440-450 (2016).
- Havlickova, B., Czaika, V. A., Friedrich, M. Epidemiological trends in skin mycoses worldwide. Mycoses. 51, 2-15 (2008).
- Wisplinghoff, H., Bischoff, T., Tallent, S. M., Seifert, H., Wenzel, R. P., Edmond, M. B. Nosocomial Bloodstream Infections in US Hospitals: Analysis of 24,179 Cases from a Prospective Nationwide Surveillance Study. Clin Infect Dis. 39 (3), 309-317 (2004).
- Romani, L. Immunity to fungal infections. Nat Rev Immunol. 4 (1), 11-24 (2004).
- Odds, F. C. Pathogenesis of Candida infections. J Am Acad Dermatol. 31 (3), S2-S5 (1994).
- MacCallum, D. M., Odds, F. C. Temporal events in the intravenous challenge model for experimental Candida albicans infections in female mice. Mycoses. 48 (3), 151-161 (2005).
- Dai, T., Kharkwal, G. B., Tanaka, M., Huang, Y. -. Y., Bil de Arce, V. J., Hamblin, M. R. Animal models of external traumatic wound infections. Virulence. 2 (4), 296-315 (2018).
- Gaspari, A. A., Burns, R., Nasir, A., Ramirez, D., Barth, R. K., Haidaris, C. G. CD86 (B7-2), but not CD80 (B7-1), expression in the epidermis of transgenic mice enhances the immunogenicity of primary cutaneous Candida albicans infections. Infect Immun. 66 (9), 4440-4449 (1998).
- Koh, A. Y. Murine models of Candida gastrointestinal colonization and dissemination. Eukaryot Cell. 12 (11), 1416-1422 (2013).
- Mear, J. B., et al. Candida albicans Airway Exposure Primes the Lung Innate Immune Response against Pseudomonas aeruginosa Infection through Innate Lymphoid Cell Recruitment and Interleukin-22-Associated Mucosal Response. Infect Immun. 82 (1), 306-315 (2014).
- Leoni, G., Neumann, P. -. A., Sumagin, R., Denning, T. L., Nusrat, A. Wound repair: role of immune-epithelial interactions. Mucosal Immunol. 8 (5), 959-968 (2015).
- Fonzi, W. A., Irwin, M. Y. Isogenic strain construction and gene mapping in Candida albicans. 유전학. 134 (3), 717-728 (1993).
- Santus, W., et al. Skin infections are eliminated by cooperation of the fibrinolytic and innate immune systems. Sci Immunol. 2 (15), (2017).
- Florescu, D. F., Brostrom, S. E., Dumitru, I., Kalil, A. C. Candida albicans Skin Abscess in a Heart Transplant Recipient. Infect Dis Clin Pract. 18 (4), 243-246 (2010).
- Pradeu, T., Cooper, E. L. The danger theory: 20 years later. Front Immunol. 3, 287 (2012).
- Cheng, A. G., DeDent, A. C., Schneewind, O., Missiakas, D. A play in four acts: Staphylococcus aureus abscess formation. Trends Microbiol. 19 (5), 225-232 (2011).
