Djup Dermal injektion som en modell av Candida albicans hudinfektion för histologiska analyser

Summary

Här beskriver vi ett protokoll som tillåter histologiska och molekylär analys av huden prover efter Candida albicans intradermal injektion. Detta protokoll upprätthåller den strukturella integriteten av huden och möjliggör lokalisering av vävnad boförälder eller nyanställd immunceller som patogen distribution.

Abstract

Huden är ett oerhört utökade organ i kroppen och på grund av denna stora yta, det utsätts kontinuerligt för mikroorganismer. Hudskador kan lätt leda till infektioner i dermis vilket i sin tur kan resultera i spridning av patogener i blodomloppet. Förstå hur immunförsvaret bekämpar infektioner i mycket tidigt skede och hur värden kan eliminera patogener är ett viktigt steg för att ange en bas för framtida terapeutiska interventioner. Här beskriver vi en modell av Candida albicans infektion som kan visualisera processer som inträffar tidigt under en infektion, inklusive när patogen har passerat den epiteliala barriären, liksom det immunsvar som framkallas av C. albicans invasionen. Vi använde denna infektion modell för att utföra histologiska analyser som visar de immunceller som infiltrerar huden samt närvaro och lokalisering av patogener. Prover som samlats in efter infektionen kan bearbetas för RNA-extraktion.

Introduction

Den mänskliga kroppen är täckt med ett extremt högt antal mikroorganismer. Hudytan är en livsmiljö av nästan en miljon bakterier per kvadratcentimeter¹. Detta nummer, dock återspeglar inte den full mängd mikroorganismer som colonizes huden. Förutom bakterier, är människokroppen koloniserade av många svamp arter, inklusive C. albicans, som är kompetent att överleva både i slemhinnor och hud nivå².

Andelen personer som diagnostiserats med svampinfektioner ökat enormt under de senaste åren. Detta beror främst på det högre antalet immunsupprimerade personer, dvs., HIV-positiva patienter och patienter som har genomgått antingen kemoterapi eller Immunosuppressiva läkemedel efter transplantation³. I en övervakning studie utförd i USA, visade Wisplinghoff et al. att 9,5% av nosokomiala blodomloppet infektioner orsakas av Candida arter⁴. På grund av ökad förekomst av svampinfektioner, och särskilt på grund av förhöjda andelen Candida arter hittade under infektioner blodomloppet, är förstå hur denna patogen flyr kontroll av immunsystemet extremt viktigt.

C. albicans är en dimorfa svamp som växer i olika morfologiska former såsom jäst, blastospores, pseudohyphae och hyfer beroende på miljöförhållanden⁵. I sin hyphal form, C. albicans visar sin högsta invasivitet kapacitet och har förmågan att penetrera epitel⁶.

C. albicans infektioner har studerats med hjälp av flera experimentella metoder. Den vanligaste modellen av infektion är intravenös injektion av C. albicans jäst⁷. Men tar denna modell inte hänsyn till alla processer som hända innan svampen lyckas sprida sig in i blodomloppet. En annan modell tar fördel av C. albicans förmåga att invadera epitel. Denna metod, även känd som den sand papper modell⁸, utvecklades av Gaspari et al. 1998⁹och består av att använda sand papper för att slipa huden, vilket eliminerar den hornlagret innan du applicerar C. albicans. Detta förfarande möjliggör svampen penetrera epitel, vilket möjliggör analys av denna patogen invasiv förmåga. Slutligen, andra modeller av infektioner för gastrointestinala¹⁰ och luftvägar¹¹ har använts i olika studier.

Bildandet av ett sår (som sand pappersmodell) orsakar aktivering av flera vägar, inklusive immunceller rekrytering och aktivering, för att främja den läkande process¹². Detta kan antingen ändra eller maskera immunsvar specifikt framkallade mot patogener, vilket leder till confounding resultat.

Här beskriver vi en metod för hudinfektion som undviker inledande såret bildandet och induktion av en basal inflammatoriska miljö. För att bibehålla intakt epitelial struktur, injicera vi direkt C. albicans i sin hyphal form i den djupa derma. Även om en enda injektion kan framkalla mild inflammation, mängden inflammation är begränsad och inskränkt jämfört med bildandet av ett öppet sår som sand pappersmodell. Den metod som vi beskriver här tillåter studier av immunsvaret mot svampinfektion och spridning samtidigt undvika överdriven och redan existerande inflammatoriska miljön som orsakas av mekaniska skador.

Protocol

Alla förfaranden som godkändes inom ramen för institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) och drivs under övervakning av Institutionen för djur resurser på barn ‘s Hospital (ARCH) vid Boston Children’s Hospital eller godkändes av italienska Hälsovårdsministeriet och utförs under den institutionella djur eftervård kommittén på det Universitetar av Milano-Bicocca. 1. C. albicans förberedelse Kultur C. albicans, stam CAF3-1<sup class="xr…

Representative Results

Genom injektion av patogenet direkt i den djupa derma förblir strukturella morfologi av vävnad intakt (figur 1A). Underhåll av huden strukturell integritet kan påvisande av immunceller och deras localization på platsen för infektion. Den högre förstoring som visas i figur 1B avslöjar att bölden består huvudsakligen av polymorfonukleära leukocyter (PMCs) som …

Discussion

Här har vi beskrivit en metod av C. albicans infektion att studera den inflammatoriska processen som är initierade vid svamp ingången i den djupa derma.

Även om hud abscess formation är en relativt sällsynt händelse på C. albicans infektion¹⁵, tillåter injektion av svampen direkt i den djupa derma inte bara studier av svamp-driven abscess formation, men även analys av specifik immun celler som deltar innehåller svamp sprida. Med den metod so…

Materials

Reagents
PBS	Euroclone	ECB4053L	warm in 37 °C bath before use
H-OCT compound	histo-line laboratories	R0030
Gill's Hematoxilyn	histo-line laboratories	09-178-2
Eosin Y solution, alcoholic	histo-line laboratories	09-209-05
Ethanol absolute	scharlau	ET00232500
Citro-HISTOCLEAR	histo-line laboratories	R0050
Eukitt, mounting medium	bio-optica
Acetone	sigma-aldrich	179124
PAS staining system	sigma-aldrich	395B-1KT
Bacto Peptone	BD	211677
Bacto Yeast Extract	BD	212750
D(+)-Glucose anhydrous for molecular biology	Applichem PanReac	50-99-7
Uridine	Merck Millipore	8451
HEPES	Applichem PanReac	A1070,0500
Safe-Lock tubes 2 mL	eppendorf	30121597
TRIzol Reagent	Life Technologies	15596018	Toxic, corrosive and mutagen. Use all precaution needed
Rneasy Mini Kit	QIAGEN	74104
liquid nitrogen			Wear eye protection
Instrument
Coulter Counter-Particle Count	Beckman Coulter
Centrifuge 5415 R	eppendorf
MC 3000 Microtome Cryostat	histo-line laboratories
TissueLiser	QIAGEN
Materials
0.3 ml Insulin Syringe with a 30G x 8mm needle	BD	324826
Surgical forceps
Surgical scissors
Base mould disposable	histo-line laboratories	2781
Positively charged bio microscope slides	bio-optica	09-2000
Cover slips 24 x 50 mm	thermo scientific	11911998