الكهروكيميائية "الكشف من الديوتريوم الحركية النظائر تأثير النقل الإلكترون خارج الخلية" في أونيدينسيس شيوانيلا السيد-1
Summary
نقدم هنا بروتوكولا لتجارب كامل الخلية الكهروكيميائية لدراسة مساهمة النقل بروتون لمعدل النقل الإلكترون خارج الخلية عن طريق cytochromes الغشاء الخارجي المعقدة في أونيدينسيس شيوانيلا السيد-1.
Abstract
المباشر الكهروكيميائية كشف ج-اكتب مجمعات الفسفرة جزءا لا يتجزأ من الغشاء الخارجي البكتيرية (الغشاء الخارجي ج-اكتب مجمعات الفسفرة؛ أوم ج-سيتس) مؤخرا ظهرت كأسلوب تحليلي كامل الخلية رواية لتوصيف نقل الإلكترون البكتيرية من سلسلة التنفس للخارج الخلية، ويشار إليه بنقل الإلكترون خارج الخلية (EET). في حين تم التحقيق بالمسار وحركية من تدفق الإلكترونات أثناء التفاعل EET، أسلوب كامل الخلية الكهروكيميائية لدراسة تأثير الأيونات الموجبة النقل المقترنة EET لم تنشأ بعد. في هذه الدراسة، مثال على تقنية البيوكيميائية لدراسة تأثير النظائر الحركية الديوتريوم (كيي) على EET خلال أوم ج-سيتس استخدام ميكروب نموذج، السيد أونيدينسيس شيوانيلا -1، وصف. يمكن الحصول على كيي في عملية EET إذا EET خلال أوم ج-سيتس بمثابة خطوة الحد من معدل الإنتاج الحالي الميكروبية. تحقيقا لهذه الغاية، قبل إضافة د2س، استعيض عن الحل طافية مع وسائط جديدة تحتوي على كمية كافية من الجهة المانحة الإلكترون لدعم معدل التفاعلات الأيضية المنبع، وإزالة الخلايا العوالق من زي موحد بيوفيلم أحادي الطبقة على مسرى العامل. الأساليب البديلة للتأكد من الحد من المعدل خطوة في الإنتاج الحالي الميكروبية ك EET خلال أوم ج-سيتس موصوفة أيضا. يمكن تطبيق لدينا تقنية مقايسة كامل الخلية الكهروكيميائية للتحقيق في حركية النقل بروتون للسلالات الجرثومية الأخرى اليكترواكتيفي.
Introduction
التقنيات الكهروكيميائية لتميز مباشرة بروتين الأكسدة والاختزال في إحدى خلايا بكتيرية سليمة ظهرت مؤخرا منذ اكتشاف السلالات الجرثومية الحد من المعادن، مثل السيد س. أونيدينسيس -1 أو سولفوريدوسينس جيوباكتير محكمة التحكيم الدائمة، التي لديها مجمعات السيتوكروم ج-نوع الغشاء الخارجي (أوم ج-سيتس) يتعرض إلى الخلية الخارجي1،2،3،،من45. أوم ج-سيتس التوسط النقل إلكترون من السلسلة التنفسية على ركائز متينة الموقع اكستراسيلولارلي. هذا النقل يشار إلى خارج الخلية الإلكترون النقل (EET)1،6 ، وهي عملية حاسمة للتكنولوجيات الحيوية الناشئة، مثل خلايا الوقود الميكروبية6. ولذلك، فهم حركية EET الكامنة، والآليات، وعلاقته فسيولوجيا الميكروبات، أوم ج-سيتس تم التحقيق باستخدام كامل الخلية كهربية4،7، جنبا إلى جنب مع الفحص المجهري 8 , 9والتحليل الطيفي10،11، والبيولوجيا الجزيئية2،4. وفي المقابل، أساليب للتحقيق أثر النقل المرتبطة EET الأيونات الموجبة، مثلاً، البروتونات، في حركية EET في الخلايا الحية نادراً ما أنشئت، رغم بروتون النقل عبر الأغشية البكتيرية التي لها دور حاسم في إشارات، والتوازن، والطاقة إنتاج12،،من1314. في هذه الدراسة، ويصف لنا تقنية لدراسة تأثير النقل بروتون في حركية EET في الخلية MR-1 أونيدينسيس س. باستخدام القياسات الكهروكيميائية كامل الخلية، الأمر الذي يتطلب تحديد الخطوة في الحد من معدل الميكروبية الإنتاج الحالي15.
هو إحدى الطرق المباشرة لتقييم مساهمة النقل بروتون على EET المرتبطة تأثير النظائر الحركية الديوتريوم (كيي). هو كي يمكن ملاحظتها كالتغيير في حركية نقل الإلكترون عند استبدال البروتونات مع أيونات الديوتريوم، الذي يمثل تأثير النقل بروتون على إلكترون نقل حركية16. تم إنشاء نظرية كيي نفسها جيدا باستخدام القياسات الكهروكيميائية بتنقية الإنزيمات17. بيد أن الإنتاج الحالي في السيد س. أونيدينسيس -1 النتائج من العمليات المتنوعة، وتقلبات متعددة،18، واحد لا يمكن ببساطة تحديد EET كعملية الحد من معدل. لمراقبة كيي في عمليات النقل بروتون يقترن EET، نحن بحاجة إلى التأكد من أن الإنتاج الحالي للميكروبات يقتصر النقل الإلكترون عبر أوم ج-سيتس لمسرى. ولهذا الغرض، قمنا باستبدال الحل طافية بالمتوسطة الطازجة التي تحتوي على تركيزات عالية من لاكتات كجهة مانحة إلكترون في الرقم الهيدروجيني الأمثل وظروف الحرارة قبل كيي القياس؛ خدم هذا الاستبدال دورين: (1) تعزيز معدل العمليات الأيضية المنبع مقارنة EET، و (2) تم حذف الخلايا السباحة في المادة طافية الإفراج عن بيوفيلم أحادي الطبقة السيد س. أونيدينسيس -1 بشأن (القطب العامل إنديوم ثلاثي أكسيد القصدير يخدر (إيتو) الكهربائي). قدم البروتوكول مفصلاً يهدف إلى مساعدة الممارسين الجديدة الحفاظ على والتأكد من أن عملية EET خطوة تحديد معدل.
Protocol
Representative Results
Discussion
لدينا تحليل كامل الخلية الكهروكيميائية له العديد من المزايا التقنية مقارنة مع البروتين كهربية. بينما يتطلب تنقية البروتين متعدد خطوة إجراءات تستغرق وقتاً طويلاً، لدينا أسلوب كامل الخلية يأخذ يوم واحد لتشكيل بيوفيلم المنظمة ذاتيا بعد زراعة الخلايا. لتحقيق تفاعل مستقرة بين أوم ج-سيت?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل ماليا معونات لتشجيع البحوث خصيصا من “الجمعية اليابانية” لتعزيز العلوم (JSPS) كاكينهي المنحة رقم 24000010، ح 17 04969، و JP17J02602، “لنا مكتب البحرية البحوث العالمية” (N62909-17-1-2038). Y.T. وهو زميل أبحاث JSPS وتدعمها JSPS من خلال البرنامج لقيادة خريج المدارس (بالجدارة).
Materials
| Glass cylinder | N/A | N/A | Custom-made, used as the electrochemical reactor |
| PTFE cover and base | N/A | N/A | Custom-made, used as a cover and a foundation of the electrochemical reactor |
| Buthyl rubber | N/A | N/A | Custom-made, inserted between each component of electrochemical reactor |
| Septa | GL Science | 3007-16101 | Used as an injection port of electrochemical reactor |
| Indium tin-doped oxide (ITO) electrode | GEOMATEC | No.0001 | Used as a working electrode, 5Ω/sq |
| Ag/AgCl KCl saturated electrode | HOKUTO DENKO | HX-R5 | Used as a reference electrode, Φ0.30mm |
| Platinum wire | The Nilaco Cooporation | PT-351325 | Used as a counter electrode |
| Luria-Bertani (LB) Broth, Miller | Becton, Dichkinson and Company | 244620 | Medium for precultivation of S. oneidensis MR-1 |
| Bacto agar | Becton, Dichkinson and Company | 214010 | |
| Anthraquinone-1-sulfonate (α-AQS) | TCI | A1428 | |
| Flavin mononucleotide (FMN) | Wako | 184-00831 | |
| NaHCO3 | Wako | 191-01305 | Used for defined medium (DM) |
| CaCl2 · 2H2O | Wako | 031-00435 | Used for DM |
| NH4Cl | Wako | 011-03015 | Used for DM |
| MgCl2 · 6H2O | Wako | 135-00165 | Used for DM |
| NaCl | Wako | 191-01665 | Used for DM |
| 2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic acid (HEPES) | DOJINDO | 346-08235 | Used for DM |
| Sodium Lactate Solution | Wako | 195-02305 | |
| Bacto Yeast Extract | Becton, Dichkinson and Company | 212750 | |
| Deuterium oxide (D, 99.9%) | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | DLM-4-PK | Additive for kinetic isotope effect experiments |
| Incubator | TOKYO RIKAKIKAI CO. LTD. | LTI-601SD | Used for precultivation |
| Shaker | TAITEC | NR-3 | Used for precultivation |
| Autoclave machine | TOMY SEIKO CO. LTD. | LSX-500 | Used for sterilization of the electrochemical reactor and the medium |
| Clean bench | SANYO | MCV-91BNF | Used to prevent the contamination of the electrochemical reactor and the medium with other microbes |
| Centrifuge separator | Eppendorf | 5430R | Rotational speed upto 6000×g is required |
| Nitrogen gas generator | Puequ CO. LTD. | PNTN-2 | Nitrogen gas cylinder can also be used instead of gas generator |
| UV-vis spectrometer | SHIMADZU | UV-1800 | Used for optimization of cell density |
| Potentiostat | BioLogic | VMP3 | Used for biofilm formation and kinetic isotope effect experiments |
| Thermal water circulator | AS ONE | TR-1A | Used for maintanance of temperature of electrochemcial reactor |
| Faraday cage | HOKUTO DENKO | HS-201S | Used for electrochemical experiments |
References
- Nealson, K. H., Saffarini, D. Iron and Manganese in Anaerobic Respiration – Environmental Significance, Physiology, and Regulation. Annu. Rev. Microbiol. 48, 311-343 (1994).
- Bretschger, O., et al. Current production and metal oxide reduction by Shewanella oneidensis MR-1 wild type and mutants. Appl Environ Microb. 73 (21), 7003-7012 (2007).
- Richter, H., et al. Cyclic voltammetry of biofilms of wild type and mutant Geobacter sulfurreducens on fuel cell anodes indicates possible roles of OmcB, OmcZ, type IV pili, and protons in extracellular electron transfer. Energy Environ. Sci. 2 (5), 506-516 (2009).
- Okamoto, A., Nakamura, R., Hashimoto, K. In-vivo identification of direct electron transfer from Shewanella oneidensis MR-1 to electrodes via outer-membrane OmcA-MtrCAB protein complexes. Electrochim. Acta. 56 (16), 5526-5531 (2011).
- Strycharz, S. M., et al. Application of cyclic voltammetry to investigate enhanced catalytic current generation by biofilm-modified anodes of Geobacter sulfurreducens strain DL1 vs. variant strain KN400. Energy Environ. Sci. 4 (3), 896-913 (2011).
- Lovley, D. R. Bug juice: harvesting electricity with microorganisms. Nat. Rev. Microbiol. 4 (7), 497-508 (2006).
- Coursolle, D., Gralnick, J. A. Reconstruction of extracellular respiratory pathways for iron(III) reduction in Shewanella oneidensis strain MR-1. Front. Microbiol. 3, (2012).
- Franks, A. E., et al. Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm. Energy Environ. Sci. 2 (1), 113-119 (2009).
- McLean, J. S., Ona, O. N., Majors, P. D. Correlated biofilm imaging, transport and metabolism measurements via combined nuclear magnetic resonance and confocal microscopy. ISME J. 2 (2), 121-131 (2008).
- Busalmen, J. P., Esteve-Nunez, A., Berna, A., Feliu, J. M. C-type cytochromes wire electricity-producing bacteria to electrodes. Angew. Chem. Int. Ed. 47 (26), 4874-4877 (2008).
- Nakamura, R., Ishii, K., Hashimoto, K. Electronic Absorption Spectra and Redox Properties of C Type Cytochromes in Living Microbes. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (9), 1606-1608 (2009).
- Myers, C. R., Nealson, K. H. Respiration-Linked Proton Translocation Coupled to Anaerobic Reduction of Manganese(IV) and Iron(III) in Shewanella putrefaciens MR-1. J. Bacteriol. 172 (11), 6232-6238 (1990).
- Tokunou, Y., Hashimoto, K., Okamoto, A. Extracellular Electron Transport Scarcely Accumulates Proton Motive Force in Shewanella oneidensis MR-1. Bull. Chem. Soc. Jpn. 88 (5), 690-692 (2015).
- Okamoto, A., Tokunou, Y., Saito, J. Cation-limited kinetic model for microbial extracellular electron transport via an outer membrane cytochrome C complex. Biophysics and physicobiology. 13, 71-76 (2016).
- Okamoto, A., Tokunou, Y., Shafeer, K., Hashimoto, K. Proton Transport in the Outer-Membrane Flavocytochrome Complex Limits the Rate of Extracellular Electron Transport. Angew. Chem. Int. Ed. 56, 9082-9086 (2017).
- Hammes-Schiffer, S., Stuchebrukhov, A. A. Theory of Coupled Electron and Proton Transfer Reactions. Chem. Rev. 110 (12), 6939-6960 (2010).
- Cleland, W. W. The use of isotope effects to determine enzyme mechanisms. J Biol. Chem. 278 (52), 51975-51984 (2003).
- Kouzuma, A., Kasai, T., Hirose, A., Watanabe, K. Catabolic and regulatory systems in Shewanella oneidensis MR-1 involved in electricity generation in microbial fuel cells. Front. Microbiol. 6, (2015).
- Kushner, D. J., Baker, A., Dunstall, T. G. Pharmacological uses and perspectives of heavy water and deuterated compounds. Can. J Physiol. Pharm. 77 (2), 79-88 (1999).
- Xie, X. S., Zubarev, R. A. Effects of Low-Level Deuterium Enrichment on Bacterial Growth. Plos One. 9 (7), e102071 (2014).
- Okamoto, A., Hashimoto, K., Nealson, K. H., Nakamura, R. Rate enhancement of bacterial extracellular electron transport involves bound flavin semiquinones. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (19), 7856-7861 (2013).
- Edwards, M. J., et al. Redox Linked Flavin Sites in Extracellular Decaheme Proteins Involved in Microbe-Mineral Electron Transfer. Sci. Rep. 5, 11677 (2015).
- Saito, J., Hashimoto, K., Okamoto, A. Flavin as an Indicator of the Rate-Limiting Factor for Microbial Current Production in Shewanella oneidensis MR-1. Electrochim. Acta. 216, 261-265 (2016).
- Guo, J. B., et al. Reduction of Cr(VI) by Escherichia coli BL21 in the presence of redox mediators. Bioresource Technol. 123, 713-716 (2012).
- Nealson, K., Saffarini, D., Moser, D., Smith, M. J. A Spectrophotometric Method for Monitoring Tactic Responses of Bacteria under Anaerobic Conditions. J Microbiol. Meth. 20 (3), 211-218 (1994).
- Myers, C. R., Myers, J. M. Cell surface exposure of the outer membrane cytochromes of Shewanella oneidensis MR-1. Lett. Appl. Microbiol. 37 (3), 254-258 (2003).
- Lower, B. H., et al. Antibody Recognition Force Microscopy Shows that Outer Membrane Cytochromes OmcA and MtrC Are Expressed on the Exterior Surface of Shewanella oneidensis MR-1. Appl. Environ. Microbiol. 75 (9), 2931-2935 (2009).
- Chen, X. X., Ferrigno, R., Yang, J., Whitesides, G. A. Redox properties of cytochrome c adsorbed on self-assembled monolayers: A probe for protein conformation and orientation. Langmuir. 18 (18), 7009-7015 (2002).
- McMillan, D. G. G., et al. The impact of enzyme orientation and electrode topology on the catalytic activity of adsorbed redox enzymes. Electrochim. Acta. 110, 79-85 (2013).
- Dinh, H. T., et al. Iron corrosion by novel anaerobic microorganisms. Nature. 427 (6977), 829-832 (2004).
- McGlynn, S. E., Chadwick, G. L., Kempes, C. P., Orphan, V. J. Single cell activity reveals direct electron transfer in methanotrophic consortia. Nature. 526 (7574), 531-535 (2015).
- Okamoto, A., Nakamura, R., Nealson, K. H., Hashimoto, K. Bound Flavin Model Suggests Similar Electron-Transfer Mechanisms in Shewanella and Geobacter. Chemelectrochem. 1 (11), 1808-1812 (2014).
- Okamoto, A., Hashimoto, K., Nealson, K. H. Flavin Redox Bifurcation as a Mechanism for Controlling the Direction of Electron Flow during Extracellular Electron Transfer. Angew. Chem. Int. Ed. 53 (41), 10988-10991 (2014).
- Tokunou, Y., Hashimoto, K., Okamoto, A. Acceleration of Extracellular Electron Transfer by Alternative Redox-Active Molecules to Riboflavin for Outer-Membrane Cytochrome c of Shewanella oneidensis MR-1. J Phys. Chem. C. 120 (29), 16168-16173 (2016).
- Rowe, A. R., et al. Tracking electron uptake from a cathode into Shewanella cells: implications for generating maintenance energy from solid substrates. bioRxiv. , 116475 (2017).
