Elektrokjemiske gjenkjenning av Deuterium Kinetic isotop effekt på ekstracellulære elektronet Transport Shewanella oneidensis MR-1
Summary
Her presenterer vi en protokoll hele celle elektrokjemiske eksperimenter å studere bidrag av proton transport til frekvensen av ekstracellulære elektronet transport via de ytre membran cytochromes i Shewanella oneidensis MR-1.
Abstract
Direkte elektrokjemiske påvisning av c-type cytochrome komplekser innebygd i den bakterielle ytre membranen (ytre membran c-skriver cytochrome komplekser; OM c– Cyts) har nylig dukket opp som en roman hele celle analysemetode å karakterisere den bakterielle elektronet transporten fra åndedretts kjeden på cellen utsiden, referert til som den ekstracellulære elektronet transporten (lunsj). Mens den veien og kinetics elektron flyt under Fornying reaksjonen er gransket, har hele celler elektrokjemiske metode å undersøke virkningen av cation transport tilknyttet EET ennå ikke blitt fastsatt. Studien, et eksempel på en biokjemisk teknikk for å undersøke deuterium kinetic isotop effekten (KIE) på EET gjennom OM c– Cyts bruker en modell mikrobe, Shewanella oneidensis MR-1, er beskrevet. KIE på EET prosessen kan oppnås hvis EET gjennom OM c– Cyts fungerer som hastighetsbegrensning trinn i mikrobiell gjeldende produksjon. For dette formål, før en D2O, ble den supernatant løsningen erstattet med friske mediet som inneholder en tilstrekkelig mengde elektron donor støtte frekvensen av oppstrøms metabolske reaksjoner og fjerne planktoniske celler fra en uniform monolayer biofilm på arbeider elektroden. Alternative metoder for å bekrefte hastighetsbegrensningen trinn i mikrobiell gjeldende produksjon som EET gjennom OM c– Cyts er også beskrevet. Våre teknikken av en hel celle elektrokjemiske analysen for å undersøke proton transport kinetics kan brukes på andre electroactive mikrobiell stammer.
Introduction
Elektrokjemiske teknikker som direkte kjennetegner en redoks protein i en intakt bakteriell celle har nylig dukket opp siden oppdagelsen av metall-reduserende mikrobiell belastninger, S. oneidensis MR-1 eller Geobacter sulfurreducens PCA, som har ytre membran c-type cytochrome komplekser (OM c-Cyts) utsatt for cellen utvendig1,2,3,4,5. OM c– Cyts formidle elektronet transport fra åndedretts kjeden til fast underlag ligger extracellularly. Denne transporten kalles ekstracellulære elektronet transport (lunsj)1,6 og er en kritisk prosess for nye bioteknologi, for eksempel mikrobielle brenselceller6. Derfor, for å forstå de underliggende EET kinetics og mekanismer, og koblingen til mikrobiell fysiologi, OM c –Cyts er gransket bruker hele-celle elektrokjemi4,7, kombinert med mikroskopi 8 , 9, spektroskopi10,11og molekylærbiologi2,4. I kontrast er metoder for å undersøke virkningen av lunsj-assosiert kasjon transport, f.eks protoner, på EET kinetics i levende celler neppe etablert, til tross for proton transport over bakteriell membraner har en avgjørende rolle i signalering, homeostase og energi produksjon12,13,14. I denne studien, vi beskriver en teknikk for å undersøke virkningen av proton transport EET kinetics i S. oneidensis MR-1 cellen med hele celle elektrokjemiske mål, som krever identifikasjonen av trinnet hastighetsbegrensning i mikrobiell gjeldende produksjon15.
En direkte måte å vurdere bidrag av proton transport på den tilknyttede EET er deuterium kinetic isotop effekten (KIE). KIE er som endring i elektron overføring kinetics ved utskifting av protoner med deuterium ioner, som representerer virkningen av proton transport elektron overføring kinetics16. Teorien om KIE selv er godt etablert elektrokjemiske målinger med renset enzymer17. Men siden gjeldende produksjon i S. oneidensis MR-1 resultater fra flere forskjellige, og varierende18, kan ikke en bare identifisere EET som hastighetsbegrensning prosessen. For å observere KIE på proton transport prosesser kombinert med lunsj, må vi bekrefte at mikrobielle gjeldende produksjon er begrenset av elektronet transport via OM c– Cyts til elektroden. For dette formålet erstattet vi den supernatant løsningen med frisk medium som inneholder en høy konsentrasjon av laktat som et elektron donor optimal pH og temperaturforhold før KIE måling; Dette erstatning servert to roller: (1) det forbedret frekvensen av oppstrøms metabolske prosesser sammenlignet Fornying, og (2) utelatt svømming cellene i nedbryting fra monolayer biofilm S. oneidensis MR-1 på arbeider elektrode ( Indium tin-dopet oksid (ITO) elektroden). Presenteres detaljert protokollen er ment å hjelpe nye utøvere opprettholde og bekrefte at EET prosessen er rente-bestemme skritt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Våre hele-celle elektrokjemiske analysen har flere tekniske fordeler sammenlignet med protein elektrokjemi. Mens protein rensing krever flere trinn tidkrevende prosedyrer, tar våre hele-cellen metoden en dag av Self-organisert biofilm formasjon etter cellekultur. For å oppnå en stabil samhandling mellom OM c– Cyts og elektroden, vi må bare sterilisering og rengjøring av elektroden overflaten; det krever ikke elektrode endringer for organisering retningen på proteiner4, f.eks</e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble økonomisk støttet av en Grant-in-Aid for spesielt forfremmet forskning fra Japan Society for fremme av vitenskap (JSPER) KAKENHI bevilgning nummer 24000010, 17H 04969, og JP17J02602, oss Office av Naval Research globalt (N62909-17-1-2038). Y.T. er stipendiat JSP og støttes av JSP gjennom programmet for ledende utdannet skoler (fortjeneste).
Materials
| Glass cylinder | N/A | N/A | Custom-made, used as the electrochemical reactor |
| PTFE cover and base | N/A | N/A | Custom-made, used as a cover and a foundation of the electrochemical reactor |
| Buthyl rubber | N/A | N/A | Custom-made, inserted between each component of electrochemical reactor |
| Septa | GL Science | 3007-16101 | Used as an injection port of electrochemical reactor |
| Indium tin-doped oxide (ITO) electrode | GEOMATEC | No.0001 | Used as a working electrode, 5Ω/sq |
| Ag/AgCl KCl saturated electrode | HOKUTO DENKO | HX-R5 | Used as a reference electrode, Φ0.30mm |
| Platinum wire | The Nilaco Cooporation | PT-351325 | Used as a counter electrode |
| Luria-Bertani (LB) Broth, Miller | Becton, Dichkinson and Company | 244620 | Medium for precultivation of S. oneidensis MR-1 |
| Bacto agar | Becton, Dichkinson and Company | 214010 | |
| Anthraquinone-1-sulfonate (α-AQS) | TCI | A1428 | |
| Flavin mononucleotide (FMN) | Wako | 184-00831 | |
| NaHCO3 | Wako | 191-01305 | Used for defined medium (DM) |
| CaCl2 · 2H2O | Wako | 031-00435 | Used for DM |
| NH4Cl | Wako | 011-03015 | Used for DM |
| MgCl2 · 6H2O | Wako | 135-00165 | Used for DM |
| NaCl | Wako | 191-01665 | Used for DM |
| 2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic acid (HEPES) | DOJINDO | 346-08235 | Used for DM |
| Sodium Lactate Solution | Wako | 195-02305 | |
| Bacto Yeast Extract | Becton, Dichkinson and Company | 212750 | |
| Deuterium oxide (D, 99.9%) | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | DLM-4-PK | Additive for kinetic isotope effect experiments |
| Incubator | TOKYO RIKAKIKAI CO. LTD. | LTI-601SD | Used for precultivation |
| Shaker | TAITEC | NR-3 | Used for precultivation |
| Autoclave machine | TOMY SEIKO CO. LTD. | LSX-500 | Used for sterilization of the electrochemical reactor and the medium |
| Clean bench | SANYO | MCV-91BNF | Used to prevent the contamination of the electrochemical reactor and the medium with other microbes |
| Centrifuge separator | Eppendorf | 5430R | Rotational speed upto 6000×g is required |
| Nitrogen gas generator | Puequ CO. LTD. | PNTN-2 | Nitrogen gas cylinder can also be used instead of gas generator |
| UV-vis spectrometer | SHIMADZU | UV-1800 | Used for optimization of cell density |
| Potentiostat | BioLogic | VMP3 | Used for biofilm formation and kinetic isotope effect experiments |
| Thermal water circulator | AS ONE | TR-1A | Used for maintanance of temperature of electrochemcial reactor |
| Faraday cage | HOKUTO DENKO | HS-201S | Used for electrochemical experiments |
References
- Nealson, K. H., Saffarini, D. Iron and Manganese in Anaerobic Respiration – Environmental Significance, Physiology, and Regulation. Annu. Rev. Microbiol. 48, 311-343 (1994).
- Bretschger, O., et al. Current production and metal oxide reduction by Shewanella oneidensis MR-1 wild type and mutants. Appl Environ Microb. 73 (21), 7003-7012 (2007).
- Richter, H., et al. Cyclic voltammetry of biofilms of wild type and mutant Geobacter sulfurreducens on fuel cell anodes indicates possible roles of OmcB, OmcZ, type IV pili, and protons in extracellular electron transfer. Energy Environ. Sci. 2 (5), 506-516 (2009).
- Okamoto, A., Nakamura, R., Hashimoto, K. In-vivo identification of direct electron transfer from Shewanella oneidensis MR-1 to electrodes via outer-membrane OmcA-MtrCAB protein complexes. Electrochim. Acta. 56 (16), 5526-5531 (2011).
- Strycharz, S. M., et al. Application of cyclic voltammetry to investigate enhanced catalytic current generation by biofilm-modified anodes of Geobacter sulfurreducens strain DL1 vs. variant strain KN400. Energy Environ. Sci. 4 (3), 896-913 (2011).
- Lovley, D. R. Bug juice: harvesting electricity with microorganisms. Nat. Rev. Microbiol. 4 (7), 497-508 (2006).
- Coursolle, D., Gralnick, J. A. Reconstruction of extracellular respiratory pathways for iron(III) reduction in Shewanella oneidensis strain MR-1. Front. Microbiol. 3, (2012).
- Franks, A. E., et al. Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm. Energy Environ. Sci. 2 (1), 113-119 (2009).
- McLean, J. S., Ona, O. N., Majors, P. D. Correlated biofilm imaging, transport and metabolism measurements via combined nuclear magnetic resonance and confocal microscopy. ISME J. 2 (2), 121-131 (2008).
- Busalmen, J. P., Esteve-Nunez, A., Berna, A., Feliu, J. M. C-type cytochromes wire electricity-producing bacteria to electrodes. Angew. Chem. Int. Ed. 47 (26), 4874-4877 (2008).
- Nakamura, R., Ishii, K., Hashimoto, K. Electronic Absorption Spectra and Redox Properties of C Type Cytochromes in Living Microbes. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (9), 1606-1608 (2009).
- Myers, C. R., Nealson, K. H. Respiration-Linked Proton Translocation Coupled to Anaerobic Reduction of Manganese(IV) and Iron(III) in Shewanella putrefaciens MR-1. J. Bacteriol. 172 (11), 6232-6238 (1990).
- Tokunou, Y., Hashimoto, K., Okamoto, A. Extracellular Electron Transport Scarcely Accumulates Proton Motive Force in Shewanella oneidensis MR-1. Bull. Chem. Soc. Jpn. 88 (5), 690-692 (2015).
- Okamoto, A., Tokunou, Y., Saito, J. Cation-limited kinetic model for microbial extracellular electron transport via an outer membrane cytochrome C complex. Biophysics and physicobiology. 13, 71-76 (2016).
- Okamoto, A., Tokunou, Y., Shafeer, K., Hashimoto, K. Proton Transport in the Outer-Membrane Flavocytochrome Complex Limits the Rate of Extracellular Electron Transport. Angew. Chem. Int. Ed. 56, 9082-9086 (2017).
- Hammes-Schiffer, S., Stuchebrukhov, A. A. Theory of Coupled Electron and Proton Transfer Reactions. Chem. Rev. 110 (12), 6939-6960 (2010).
- Cleland, W. W. The use of isotope effects to determine enzyme mechanisms. J Biol. Chem. 278 (52), 51975-51984 (2003).
- Kouzuma, A., Kasai, T., Hirose, A., Watanabe, K. Catabolic and regulatory systems in Shewanella oneidensis MR-1 involved in electricity generation in microbial fuel cells. Front. Microbiol. 6, (2015).
- Kushner, D. J., Baker, A., Dunstall, T. G. Pharmacological uses and perspectives of heavy water and deuterated compounds. Can. J Physiol. Pharm. 77 (2), 79-88 (1999).
- Xie, X. S., Zubarev, R. A. Effects of Low-Level Deuterium Enrichment on Bacterial Growth. Plos One. 9 (7), e102071 (2014).
- Okamoto, A., Hashimoto, K., Nealson, K. H., Nakamura, R. Rate enhancement of bacterial extracellular electron transport involves bound flavin semiquinones. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (19), 7856-7861 (2013).
- Edwards, M. J., et al. Redox Linked Flavin Sites in Extracellular Decaheme Proteins Involved in Microbe-Mineral Electron Transfer. Sci. Rep. 5, 11677 (2015).
- Saito, J., Hashimoto, K., Okamoto, A. Flavin as an Indicator of the Rate-Limiting Factor for Microbial Current Production in Shewanella oneidensis MR-1. Electrochim. Acta. 216, 261-265 (2016).
- Guo, J. B., et al. Reduction of Cr(VI) by Escherichia coli BL21 in the presence of redox mediators. Bioresource Technol. 123, 713-716 (2012).
- Nealson, K., Saffarini, D., Moser, D., Smith, M. J. A Spectrophotometric Method for Monitoring Tactic Responses of Bacteria under Anaerobic Conditions. J Microbiol. Meth. 20 (3), 211-218 (1994).
- Myers, C. R., Myers, J. M. Cell surface exposure of the outer membrane cytochromes of Shewanella oneidensis MR-1. Lett. Appl. Microbiol. 37 (3), 254-258 (2003).
- Lower, B. H., et al. Antibody Recognition Force Microscopy Shows that Outer Membrane Cytochromes OmcA and MtrC Are Expressed on the Exterior Surface of Shewanella oneidensis MR-1. Appl. Environ. Microbiol. 75 (9), 2931-2935 (2009).
- Chen, X. X., Ferrigno, R., Yang, J., Whitesides, G. A. Redox properties of cytochrome c adsorbed on self-assembled monolayers: A probe for protein conformation and orientation. Langmuir. 18 (18), 7009-7015 (2002).
- McMillan, D. G. G., et al. The impact of enzyme orientation and electrode topology on the catalytic activity of adsorbed redox enzymes. Electrochim. Acta. 110, 79-85 (2013).
- Dinh, H. T., et al. Iron corrosion by novel anaerobic microorganisms. Nature. 427 (6977), 829-832 (2004).
- McGlynn, S. E., Chadwick, G. L., Kempes, C. P., Orphan, V. J. Single cell activity reveals direct electron transfer in methanotrophic consortia. Nature. 526 (7574), 531-535 (2015).
- Okamoto, A., Nakamura, R., Nealson, K. H., Hashimoto, K. Bound Flavin Model Suggests Similar Electron-Transfer Mechanisms in Shewanella and Geobacter. Chemelectrochem. 1 (11), 1808-1812 (2014).
- Okamoto, A., Hashimoto, K., Nealson, K. H. Flavin Redox Bifurcation as a Mechanism for Controlling the Direction of Electron Flow during Extracellular Electron Transfer. Angew. Chem. Int. Ed. 53 (41), 10988-10991 (2014).
- Tokunou, Y., Hashimoto, K., Okamoto, A. Acceleration of Extracellular Electron Transfer by Alternative Redox-Active Molecules to Riboflavin for Outer-Membrane Cytochrome c of Shewanella oneidensis MR-1. J Phys. Chem. C. 120 (29), 16168-16173 (2016).
- Rowe, A. R., et al. Tracking electron uptake from a cathode into Shewanella cells: implications for generating maintenance energy from solid substrates. bioRxiv. , 116475 (2017).
