Summary

Polysome Leishmania, 인간 세포 및 마우스 고환에서 프로 파일링

Published: April 08, 2018
doi:

Summary

Polysome 프로 파일링 기술의 전반적인 목표 단백질 합성 하는 동안 개별 mRNAs 또는 transcriptome mRNAs의 변환 활동의 분석입니다. 방법은 단백질 합성 규제, 번역 활성화 및 건강과 여러 인간의 질병에 억압의 연구에 대 한 중요 합니다.

Abstract

적절 한 단백질 식 및 오른쪽 금액에 적절 한 시기에 정상적인 세포 기능 및 빠르게 변화 하는 환경에서 생존의 기초 이다. 오랜 동안에, 유전자 표현 연구 transcriptional 수준에 대 한 연구에 의해 지배 되었다. 그러나, mRNAs의 정상 수준을 잘 단백질 생산, 연관 되지 않습니다 그리고 translatability mRNAs의 조건에 따라 크게 다릅니다. Leishmania, 기생충 같은 몇몇 유기 체에서 단백질 식이 주로 변환 수준에서 통제 된다. 최근 연구는 단백질 번역 dysregulation는 암, 대사, 신경 및 기타 인간의 질병 관련 된 시연 했다. Polysome 프로 파일링 단백질 번역 규칙을 공부 하는 강력한 방법입니다. 그것은 개별 mRNAs의 변환 상태를 측정 하거나 게놈 넓은 규모에 번역을 검토 수 있습니다. 이 기법의 기초 polysomes, 리보솜, 그들의 소 단위 및 자당 그라디언트를 통해 lysate는 세포질의 원심 분리 동안 무료 mRNAs의 분리 이다. 여기, 우리가 현재 보편적인 polysome 프로 파일링 사용 되는 프로토콜에 세 가지 모델-기생충 주요 Leishmania, 경작된 한 인간 세포 및 동물의 조직. Leishmania 셀 서 스 펜 션에서 자유롭게 성장 하 고 마우스 고환 동물 조직 샘플을 나타내는 부착 단층에서 경작된 한 인간 세포 성장. 따라서, 기술은 이러한 소스의 모든 적응 이다. Polysomal 분수의 분석을 위한 프로토콜 개별 mRNA 수준의 실시간 정량 Pcr에 의해 서쪽 오 점 및 전기 이동 법에 의해 리보솜 RNAs의 분석에 의해 단백질의 탐지를 포함 한다. 메서드는 분수의 질량 분광학에 의해 mRNAs 연관 깊은 RNA-seq에 의해 transcriptome 수준에 리보솜의 검사 및 리보솜 관련 단백질의 분석에 의해 더 확장할 수 있다. 메서드는 다른 생물 학적 모델을 쉽게 조정할 수 있습니다.

Introduction

세포에 있는 유전자 발현의 규칙 transcriptional, posttranscriptional 및 posttranslational 메커니즘에 의해 제어 됩니다. 깊은 RNA 시퀀싱에서 전례 없는 수준에 게놈 넓은 규모에 정상 mRNA 수준의 연구를 수 있습니다. 그러나, 최근 연구 결과 밝혀 정상 mRNA 수준은 단백질 생산1,2와 항상 연결 되지 않습니다. 개별 성적표의 운명 매우 복잡 하 고 내부/외부 자극, 스트레스 등과같은 많은 요인에 따라 달라 집니다. 단백질 종합 동안에 유전자 발현의 규칙 변화에 신속한 대응에 필요한 식 컨트롤의 또 다른 레이어를 제공 합니다. 프로 파일링, 분리 및 리보솜, 적극적으로 번역의 시각화 polysome (또는 “polyribosome”) 단백질 종합의 규칙을 공부 하는 강력한 방법입니다. 비록, 그것의 첫번째 실험적인 응용 프로그램 1960 년대3에 등장, polysome 프로 파일링은 현재 단백질 번역 연구4에서 가장 중요 한 기술 중 하나. 단일 mRNAs는 polysome의 형성을 선도 하는 하나 이상의 리보솜에 의해 번역 될 수 있다. 성적 증명서 cycloheximide5 리보솜에 지연 수 있습니다 및 mRNAs polysomes의 다른 숫자를 포함 하 여 자당 그라데이션 ultracentrifugation6,7 polysome 분류 과정에서 분리 될 수 있다 , 8 , 9. polysomal 분수의 RNA 분석 수 있습니다 개별 mRNAs의 변환 상태에 변화의 측정 및 다른 생리 적인 조건4,7, 중 게놈 넓은 규모에 10. 5′ UTR 및 3′ UTR 시퀀스 mRNA translatability11의 제어의 역할을 공개, 번역 상 진압12miRNAs의 역할을 검토, 리보솜 속13에에서 결함을 밝히기 메서드를 또한 사용 , 인간의 질병14,15리보솜 관련 단백질의 역할을 이해 하 고. 지난 10 년 동안 번역 중 유전자 발현의 규칙을 위한 성장 역할 인간의 질병에 그것의 중요성을 나타내는 등장 했습니다. 암, 대사에 변환 제어 및 신경 퇴행 성 질환에 대 한 증거는 압도적인15,,1617,18. EIF4E-종속 변환 제어의 dysregulation에 기여 하는 예를 들어 자폐증 관련 적자15 와 FMRP은 자폐증14에 연결 된 mRNAs에 리보솜의 연기에 참여 하 고. 따라서, polysomal 프로 파일링 변환 여러 인간 질병에 있는 결함을 공부 하는 매우 중요 한 도구입니다.

다른 생리 적인 조건 하에서 polysomal 분수의 단백질 분석 번역 중 리보솜과 관련 된 요인의 기능 dissects. Polysome 프로 파일링 기법 등 효 모, 포유류 세포, 식물, 원생 동물10,19,,2021많은 종에서 사용 되었습니다. TrypanosomaLeishmania protozoan 기생충 유전자 발현의 제한 된 transcriptional 제어를 전시 한다. 그들의 유전자는 polycistronic 유전자 클러스터 발기인 통제 전사22부족으로 구성 됩니다. 대신, 발달 유전자 발현은 주로 단백질 번역 및 trypanosomatid 종23,24에 mRNA 안정성의 수준에서 제어 됩니다. 따라서, 이해 transcriptional 규칙의 부재에서 변환 제어의이 유기 체에 대 한 특히 중요 하다. Polysomal 프로 파일링 Leishmania25,26,,2728에 유전자 발현의 posttranscriptional 레 귤 레이 션을 공부 하는 강력한 도구입니다.

진짜 개인적인 mRNAs 레벨의 검출에 최근 진행 시간 정량 PCR (RT-정량) 및 차세대 시퀀싱, 프로 테오 믹스 기술에 의해 전체 transcriptome, 해상도 새로운 수준 polysomal 프로 파일링의 장점을 제공 합니다. 이러한 메서드를 사용 하 여 깊은 RNA 시퀀싱 proteomic 분석 게놈 넓은 규모에 셀의 변환 상태를 모니터링을 결합 하 여 개별 polysomal 분수의 분석에 의해 더 확장 수 있습니다. 다른 생리 적 및 병 적인 조건 하에서 번역을 규제 하는 새로운 분자 선수의 식별 수 있습니다. 여기, 우리는 세 가지 모델에 사용 되는 프로토콜을 프로 파일링 범용 polysome 제시: 기생충 주요 Leishmania, 경작된 한 인간 세포 및 동물의 조직. 우리는 다른 유기 체, 그라데이션 조건의 최적화, RNase 억제제의 선택과 polysome 분수가이 연구에서 분석 하는 실시간 정량, 서쪽 오 점 및 RNA 전기 이동 법의 응용 프로그램에서 세포 lysates의 준비에 조언을 제시.

Protocol

모든 동물 치료 및 연구에서 얻은 조직의 취급 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 국가 학회에 택 사스 기술 대학 건강 과학 센터에 의해 승인 하는 프로토콜에 따라 수행 했다 건강 동물 복지 지침, 프로토콜 번호 96005입니다. 척 추가 있는 동물을 희생 하 고 지침에 따라 조직 기관 동물 관리 및 사용 위원회에서 준비 하십시오. 이러한 위원회 부족, 건강의 국가 학회 동물 복지 가이드라인을 참조 ?…

Representative Results

이 연구에서는 3 개의 서로 다른 소스에 polysomal 프로 파일링 기술의 응용 프로그램 설명: 기생 주요 Leishmania, 경작된 한 인간 세포 및 마우스 고환. Leishmania 세포 현 탁 액에 있는 액체 매체에서 자유롭게 성장, 경작된 한 인간 세포 플레이트에 부착 단층에서 성장 하 고 마우스 고환 조직 샘플을 나타냅니다. 메서드를 사용 하면 다른 종류의 서 스 펜 션, 다양 ?…

Discussion

자당 기온 변화도 의해 polysome 분별 RNA와 결합 및 분수의 단백질 분석은 개별 mRNAs 또는 전체 translatome의 변환 상태 뿐만 아니라 변환 조절 단백질 요인의 역할을 분석 하는 강력한 방법을 정상적인 생리 적 또는 질병 상태 기계입니다. Polysomal 프로 파일링은 Leishmania transcriptional 제어 크게 결 석 하 고 유전자 표현 규제는 주로 발생을 포함 하는 trypanosomatids와 같은 유기 체에 있는 변환 규칙을 …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자는 오디오 녹음에 대 한 칭이 감사합니다. 연구 택 사스 기술 대학 건강 과학 센터에서 창업 자금에 의해 지원 되었다 및 변환 신경 과학 및 치료제 (CTNT) 우수의 센터에 의해 부여 PN CTNT 2017-05 AKHRJDHW A.L.K.; NIH 교부 금에 의해 부분에서 R01AI099380 K.Z. 제임스 C. 퍼레이드와 순 영 R. Baca CISER (줄기의 통합 교육 및 연구를 위한 센터) 학자 고 프로그램에 의해 지원 되었다.

Materials

Instruments:
Gradient master Biocomp Instruments Inc. 108
Piston Gradient Fractionator Biocomp Instruments Inc. 152
Fraction collector Gilson, Inc. FC203B
NanoDrop One Thermo Scientific NanoDrop One
Nikon inverted microscope Nikon ECLIPSE Ts2-FL/Ts2
2720 Thermal Cycler Applied Biosystems by Life Technologies 4359659
CO2 incubator Panasonic Healthcare Co. MCO-170A1CUV
HERATHERM incubator Thermo Scientific 51028063
Biological Safety Cabinet, class II, type A2 NuAire Inc. NU-543-400
Revco freezer Revco Technologies ULT1386-5-D35
Beckman L8-M Ultracentifuge Beckman Coulter L8M-70
Centrifuge Eppendorf 5810R
Centrifuge Eppendorf 5424
Ultracentrifuge Rotor SW41 Beckman Coulter 331362
Swing-bucket rotor Eppendorf A-4-62
Fixed angle rotor Eppendorf F-45-30-11
Quant Studio 12K Flex Real-Time PCR machine 285880228 Applied Biosystems by life technologies 4470661
TC20 Automated cell counter Bio-Rad 145-0102
Hemacytometer Hausser Scientific 02-671-51B
Software 
Triax software  Biocomp Instruments Inc.
Materials:
Counting slides, dual chamber for cell counter Bio-Rad 145-0011
1.5 mL microcentrifuge tube USA Scientific 1615-5500
Open-top polyclear centrifuge tubes, (14 mm x 89 mm) Seton Scientific 7030
Syringe, 5 mL BD 309646
BD Syringe 3 mL23 Gauge 1 Inch Needle BD 10020439
Nunclon Delta Surface plate, 14 cm Thermo Scientific 168381
Nunclon Delta Surface plate, 9 cm Thermo Scientific 172931
Nalgene rapid-flow 90mm filter unit, 500 mL, 0.2 aPES Thermo Scientific 569-0020
BioLite 75 cm3 flasks Thermo Scientific 130193
Nunc 50 mL conical centrifuge tubes Thermo Scientific 339653
Chemicals:
Trizol LS Ambion by Life Technologies 10296028
HEPES Fisher Scientific BP310-500
Trizma base Sigma T1378-5KG
Dulbecco's Modified Eagle's Medium-high glucose (DMEM) Sigma D6429-500ML
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F0926-50ML
Penicillin-Streptomycin (P/S) Sigma P0781-100ML
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-019
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) Sigma D8537-500ML
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2x6H2O) Acros Organics AC413415000
Potassium Chloride (KCl) Sigma P9541-500G
Nonidet P 40 (NP-40) Fluka (Sigma-Aldrich) 74385
Recombinant Rnasin Ribonuclease Inhibitor Promega N2511
Heparin sodium salt Sigma H3993-1MU
cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitors Roche Diagnostics 11836170001
Glycogen Thermo Scientific R0551
Water Sigma W4502-1L
Cycloheximide Sigma C7698-1G
Chloroform Fisher Scientific 194002
Dithiotreitol (DTT) Fisher Scientific BP172-5
Ethidium Bromide Fisher Scientific BP-1302-10
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium dehydrate (EDTA) Fisher Scientific S316-212
Optimem Life Technologies 22600050
Puromycin dihydrochloride Sigma P8833-100MG
Sucrose Fisher Scientific S5-3KG
Trypsin-EDTA solution Sigma T4049-100ML
Hgh Capacity cDNA Reverse Transcriptase Kit Applied Biosystems by life technologies 4368814
Power SYBR Green PCR Master Mix Applied Biosystems by life technologies 4367659
HCl Fisher Scientific A144SI-212
Isopropanol Fisher Scientific BP26324
Potassium Hydroxide (KOH) Sigma 221473-500G
Anti-RPL11 antibody Abcam ab79352
Ribosomal protein S6 (C-8) antibody Santa Cruz Biotechnology Inc. sc-74459
1xM199 Sigma M0393-10X1L
Lithium cloride Sigma L-9650
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific D128-500
Gel Loading Buffer II Thermo Scientific AM8546G
UltraPure Agarose Thermo Scientific 16500-100
Trichloracetic acid (TCA) Fisher Scientific A322-100
SuperSignal West Pico PLUS chemiluminescent substrate Thermo Scientific 34580
Formaldehyde Fisher Scientific BP531-500
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Sigma L5750-1KG
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Sigma P7626-5G
RNeasy Mini kit Qiagen 74104
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) Sigma A1852-1VL
Cytosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (CTP) Sigma C1506-250MG
Uridine 5'-triphosphate trisodium salt hydrate (UTP) Sigma U6625-100MG
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate (GTP) Sigma G8877-250MG
SP6 RNA Polymerase NEB M0207S
Pyrophoshatase Sigma I1643-500UN
Spermidine Sigma S0266-1G

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Karamysheva, Z. N., Tikhonova, E. B., Grozdanov, P. N., Huffman, J. C., Baca, K. R., Karamyshev, A., Denison, R. B., MacDonald, C. C., Zhang, K., Karamyshev, A. L. Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis. J. Vis. Exp. (134), e57600, doi:10.3791/57600 (2018).

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