Summary

Polysome profilering i Leishmania, menneskelige celler og mus testikkel

Published: April 08, 2018
doi:

Summary

Det overordnede målet med polysome profilering teknikk er analyse av translasjonsforskning aktivitet individuelle mRNAs eller transcriptome mRNAs under proteinsyntese. Metoden er viktig for studier av protein syntese regulering, oversettelse aktivisering og undertrykkelse i helse og flere menneskelige sykdommer.

Abstract

Riktig protein uttrykk til rett tid og i riktige mengder er grunnlaget for normal celle funksjon og overlevelse i et raskt skiftende miljø. I lang tid, ble gene expression studiene dominert av forskning på transcriptional nivå. Imidlertid stabil nivåene av mRNAs samsvarer ikke med protein produksjon, og translatability av mRNAs varierer sterkt avhengig av forholdene. I noen organismer, som parasitten Leishmania, er det protein uttrykket regulert hovedsakelig på translasjonsforskning nivå. Nyere studier har vist at protein oversettelsen feilregulering er knyttet til kreft, metabolsk, nevrodegenerative og andre menneskelige sykdommer. Polysome profilering er en kraftig metode å studere protein oversettelsen regulering. Det kan måle translasjonsforskning statusen for individuelle mRNAs eller undersøke oversettelse i genomet-bred skala. Grunnlaget for denne teknikken er separasjon av polysomes, ribosomer, tillates underorganisasjoner og gratis mRNAs under sentrifugering av en cytoplasmatiske lysate gjennom sukrose gradering. Her presenterer vi en universell polysome profilering protokollen brukes på tre forskjellige modeller – parasitten Leishmania store, kultivert menneskelige celler og dyr vev. Leishmania cellene vokse fritt i suspensjon og kultivert menneskelige celler vokse i tilhenger monolayer, mens mus testikkel representerer en dyr Vevsprøve. Dermed er teknikken tilpasset alle disse kildene. Protokollen for analyse av polysomal fraksjoner inneholder påvisning av individuelle mRNA nivåer av RT-qPCR, proteiner ved Western blot og analyse av ribosomal RNAs av geleelektroforese. Metoden kan fremme utbygget av undersøkelse av mRNAs tilknytning ribosom på transcriptome nivå av dyp RNA-seq og analyse av ribosom-assosiert proteiner av masse spektroskopi av fraksjoner. Metoden kan enkelt justeres til andre biologiske modeller.

Introduction

Regulering av genuttrykk i celler styres av transcriptional, posttranscriptional og posttranslational. Fremskritt i dyp RNA sekvensering tillate studiet av stabil mRNA nivåer i genomet-bred skala på et enestående nivå. Men avslørte nyere funn at stabil mRNA nivå ikke alltid samsvarer med protein produksjon1,2. Skjebnen til en individuell transkripsjon er svært kompleks og avhenger av mange faktorer som interne/eksterne stimuli, stress, osv. Regulering av genuttrykk under proteinsyntese gir et annet lag uttrykket kontroll nødvendig for en rask reaksjon på skiftende forhold. Polysome (eller “polyribosome”) profilering, separasjon og visualisering aktivt oversette ribosomer, er en kraftig metode å studere regulering av proteinsyntese. Selv om sin første eksperimentelle søknadene dukket opp i 1960-tallet3, er polysome profilering en av de viktigste teknikkene i protein oversettelsen studier4. Enkelt mRNAs kan oversettes av flere ribosom fører til dannelsen av en polysome. Utskrifter kan bli stoppet på ribosomer med gapestokk5 og mRNAs som inneholder forskjellig antall polysomes kan skilles under polysome fraksjoneres av sukrose gradient ultracentrifugation6,7 , 8 , 9. RNA analyse av polysomal fraksjoner så lar måling av endringer i individuelle mRNAs translasjonsforskning statene på genomet-bred skala og under ulike fysiologiske forhold4,7, 10. metoden er også brukt til å avsløre rollene 5′ UTR og 3 UTR sekvenser kontroll over mRNA translatability11, undersøke rollen av miRNAs i translasjonsforskning undertrykkelse12, avdekke feil i ribosom biogenesis13 , og forstå rollen ribosom-assosiert proteiner med menneskelige sykdommer14,15. I løpet av det siste tiåret, har en voksende rolle for regulering av genuttrykk under oversettelsen framstått som illustrerer sin betydning i menneskelige sykdommer. Bevisene for translasjonsforskning kontroll i Krepsen, metabolske og nevrodegenerative sykdommer er overveldende15,16,17,18. For eksempel feilregulering eIF4E-avhengige translasjonsforskning kontroll bidrar til autisme relaterte underskudd15 og FMRP er involvert i drøye ut av ribosomer på mRNAs knyttet til autisme14. Dermed er polysomal profilering et svært viktig verktøy for å studere defekter i translasjonsforskning regulering i flere menneskelige sykdommer.

Protein analyse av polysomal fraksjoner under ulike fysiologiske forhold dissekerer funksjonen av faktorer assosiert med ribosomer under oversetting. Polysome profilering teknikken har vært brukt i mange arter inkludert gjær, pattedyrceller, planter og protozoer10,19,20,21. Protozoan parasitter som Trypanosoma og Leishmania utstilling begrenset transcriptional kontroll av genuttrykk. Deres genomer organiseres i polycistronic gene klynger som mangler promoter regulert transkripsjon22. I stedet styres utviklingsmessige genuttrykk hovedsakelig på protein oversettelsen og mRNA stabilitet i trypanosomatid arter23,24. Forståelse av translasjonsforskning kontroll i fravær av transcriptional er derfor spesielt viktig for disse organismene. Polysomal profilering er et kraftig verktøy for å studere posttranscriptional regulering av byggkorn under Leishmania25,26,27,28.

Framskritt i deteksjon av personlige mRNAs nivåer av ekte kvantitative PCR (RT-qPCR) og hele transcriptome av neste generasjons sekvensering, samt Proteomikk teknologier, bringer oppløsning og fordeler av polysomal profilering til et nytt nivå. Bruk av disse metodene kan fremme utbygget av analyse av individuelle polysomal fraksjoner av dyp RNA sekvensering kombinert med proteomic analyse for å overvåke translasjonsforskning statusen til celler i en genome-bred skala. Dette gjør identifisering av nye molekylær spillere regulere oversettelse under ulike fysiologiske og patologiske forhold. Her presenterer vi en universell polysome profilering protokollen brukes på tre forskjellige modeller: den parasitten Leishmania store, kultivert menneskelige celler og dyr vev. Vi presenterer råd om utarbeidelse av celle lysates fra ulike organismer, optimalisering av gradient, valg av RNase hemmere og anvendelse av RT-qPCR, Western blot og RNA geleelektroforese for å analysere polysome brøker i denne studien.

Protocol

Alle dyr behandling og håndtering av vev innhentet i studien ble utført i henhold til protokoller godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteen ved Texas Tech University Health Science Center i henhold til National Institutes of Helse dyrevelferd retningslinjer, Protokollnummer 96005. Vennligst ofre vertebrate dyr og forberede vev i henhold til retningslinjer fra institusjonelle Animal Care og bruk komiteen. Hvis mangler slik en komité, se National Institutes of Health dyrevelferd retningslinjene. Voksen (>…

Representative Results

I denne studien vi beskriver bruken av polysomal profilering teknikken til tre forskjellige kilder: parasittiske Leishmania store, kultivert menneskelige celler og mus testikkel. Leishmania cellene vokse fritt i flytende media i suspensjon kultivert menneskelig cellene vokse i tilhenger monolayer på plater og mus testikkel representerer en Vevsprøve. Metoden kan enkelt justeres til andre typer fritt voksen celler i suspensjon, ulike typer vev, eller fra en annen organi…

Discussion

Polysome fraksjoneres av sukrose gradering kombinert med RNA og protein av fraksjoner er en kraftig metode å analysere translasjonsforskning statusen til individuelle mRNAs eller hele translatome og roller protein faktorer regulere translasjonsforskning maskiner under normale fysiologiske eller sykdom tilstand. Polysomal profilering er en særlig egnet teknikk å studere translasjonsforskning regulering i organismer som trypanosomatids inkludert Leishmania der transcriptional er hovedsakelig fraværende og gene…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne takker Ching Lee hjelpen lydopptak. Forskningen ble støttet av oppstart midler fra Texas Tech University Health Sciences Center og ved Center of Excellence for translasjonsforskning nevrovitenskap og Therapeutics (CTNT) gi PN-CTNT 2017-05 AKHRJDHW A.L.K.; delvis av NIH grant R01AI099380 K.Z. James C. Huffman og Kristen R. Baca var CISER (senter for integrering av STEM utdanning og forskning) forskere og ble støttet av programmet.

Materials

Instruments:
Gradient master Biocomp Instruments Inc. 108
Piston Gradient Fractionator Biocomp Instruments Inc. 152
Fraction collector Gilson, Inc. FC203B
NanoDrop One Thermo Scientific NanoDrop One
Nikon inverted microscope Nikon ECLIPSE Ts2-FL/Ts2
2720 Thermal Cycler Applied Biosystems by Life Technologies 4359659
CO2 incubator Panasonic Healthcare Co. MCO-170A1CUV
HERATHERM incubator Thermo Scientific 51028063
Biological Safety Cabinet, class II, type A2 NuAire Inc. NU-543-400
Revco freezer Revco Technologies ULT1386-5-D35
Beckman L8-M Ultracentifuge Beckman Coulter L8M-70
Centrifuge Eppendorf 5810R
Centrifuge Eppendorf 5424
Ultracentrifuge Rotor SW41 Beckman Coulter 331362
Swing-bucket rotor Eppendorf A-4-62
Fixed angle rotor Eppendorf F-45-30-11
Quant Studio 12K Flex Real-Time PCR machine 285880228 Applied Biosystems by life technologies 4470661
TC20 Automated cell counter Bio-Rad 145-0102
Hemacytometer Hausser Scientific 02-671-51B
Software 
Triax software  Biocomp Instruments Inc.
Materials:
Counting slides, dual chamber for cell counter Bio-Rad 145-0011
1.5 mL microcentrifuge tube USA Scientific 1615-5500
Open-top polyclear centrifuge tubes, (14 mm x 89 mm) Seton Scientific 7030
Syringe, 5 mL BD 309646
BD Syringe 3 mL23 Gauge 1 Inch Needle BD 10020439
Nunclon Delta Surface plate, 14 cm Thermo Scientific 168381
Nunclon Delta Surface plate, 9 cm Thermo Scientific 172931
Nalgene rapid-flow 90mm filter unit, 500 mL, 0.2 aPES Thermo Scientific 569-0020
BioLite 75 cm3 flasks Thermo Scientific 130193
Nunc 50 mL conical centrifuge tubes Thermo Scientific 339653
Chemicals:
Trizol LS Ambion by Life Technologies 10296028
HEPES Fisher Scientific BP310-500
Trizma base Sigma T1378-5KG
Dulbecco's Modified Eagle's Medium-high glucose (DMEM) Sigma D6429-500ML
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F0926-50ML
Penicillin-Streptomycin (P/S) Sigma P0781-100ML
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-019
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) Sigma D8537-500ML
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2x6H2O) Acros Organics AC413415000
Potassium Chloride (KCl) Sigma P9541-500G
Nonidet P 40 (NP-40) Fluka (Sigma-Aldrich) 74385
Recombinant Rnasin Ribonuclease Inhibitor Promega N2511
Heparin sodium salt Sigma H3993-1MU
cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitors Roche Diagnostics 11836170001
Glycogen Thermo Scientific R0551
Water Sigma W4502-1L
Cycloheximide Sigma C7698-1G
Chloroform Fisher Scientific 194002
Dithiotreitol (DTT) Fisher Scientific BP172-5
Ethidium Bromide Fisher Scientific BP-1302-10
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium dehydrate (EDTA) Fisher Scientific S316-212
Optimem Life Technologies 22600050
Puromycin dihydrochloride Sigma P8833-100MG
Sucrose Fisher Scientific S5-3KG
Trypsin-EDTA solution Sigma T4049-100ML
Hgh Capacity cDNA Reverse Transcriptase Kit Applied Biosystems by life technologies 4368814
Power SYBR Green PCR Master Mix Applied Biosystems by life technologies 4367659
HCl Fisher Scientific A144SI-212
Isopropanol Fisher Scientific BP26324
Potassium Hydroxide (KOH) Sigma 221473-500G
Anti-RPL11 antibody Abcam ab79352
Ribosomal protein S6 (C-8) antibody Santa Cruz Biotechnology Inc. sc-74459
1xM199 Sigma M0393-10X1L
Lithium cloride Sigma L-9650
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific D128-500
Gel Loading Buffer II Thermo Scientific AM8546G
UltraPure Agarose Thermo Scientific 16500-100
Trichloracetic acid (TCA) Fisher Scientific A322-100
SuperSignal West Pico PLUS chemiluminescent substrate Thermo Scientific 34580
Formaldehyde Fisher Scientific BP531-500
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Sigma L5750-1KG
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Sigma P7626-5G
RNeasy Mini kit Qiagen 74104
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) Sigma A1852-1VL
Cytosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (CTP) Sigma C1506-250MG
Uridine 5'-triphosphate trisodium salt hydrate (UTP) Sigma U6625-100MG
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate (GTP) Sigma G8877-250MG
SP6 RNA Polymerase NEB M0207S
Pyrophoshatase Sigma I1643-500UN
Spermidine Sigma S0266-1G

References

  1. Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
  2. Capewell, P., et al. Regulation of Trypanosoma brucei Total and Polysomal mRNA during Development within Its Mammalian Host. PLoS One. 8 (6), e67069 (2013).
  3. Warner, J. R., Knopf, P. M., Rich, A. A multiple ribosomal structure in protein synthesis. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 49, 122-129 (1963).
  4. Piccirillo, C. A., Bjur, E., Topisirovic, I., Sonenberg, N., Larsson, O. Translational control of immune responses: from transcripts to translatomes. Nature Immunology. 15 (6), 503-511 (2014).
  5. Ennis, H. L., Lubin, M. Cycloheximide: Aspects of Inhibition of Protein Synthesis in Mammalian Cells. Science. 146 (3650), 1474-1476 (1964).
  6. Masek, T., Valasek, L., Pospisek, M. Polysome analysis and RNA purification from sucrose gradients. Methods in Molecular Biology. 703, 293-309 (2011).
  7. Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. Journal of Visualized Experiments. (87), (2014).
  8. Zuccotti, P., Modelska, A. Studying the Translatome with Polysome Profiling. Methods in Molecular Biology. 1358, 59-69 (2016).
  9. Chasse, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Research. 45 (3), e15 (2017).
  10. Arava, Y., et al. Genome-wide analysis of mRNA translation profiles in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 100 (7), 3889-3894 (2003).
  11. Gandin, V., et al. nanoCAGE reveals 5′ UTR features that define specific modes of translation of functionally related MTOR-sensitive mRNAs. Genome Research. 26 (5), 636-648 (2016).
  12. Bazzini, A. A., Lee, M. T., Giraldez, A. J. Ribosome profiling shows that miR-430 reduces translation before causing mRNA decay in zebrafish. Science. 336 (6078), 233-237 (2012).
  13. Zanchin, N. I., Goldfarb, D. S. Nip7p interacts with Nop8p, an essential nucleolar protein required for 60S ribosome biogenesis, and the exosome subunit Rrp43p. Molecular Cell Biology. 19 (2), 1518-1525 (1999).
  14. Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146 (2), 247-261 (2011).
  15. Gkogkas, C. G., et al. Autism-related deficits via dysregulated eIF4E-dependent translational control. Nature. 493 (7432), 371-377 (2013).
  16. Robichaud, N., Sonenberg, N. Translational control and the cancer cell response to stress. Curr Opin Cell Biol. 45, 102-109 (2017).
  17. Gordon, B. S., Kelleher, A. R., Kimball, S. R. Regulation of muscle protein synthesis and the effects of catabolic states. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 45 (10), 2147-2157 (2013).
  18. Ishimura, R., et al. RNA function. Ribosome stalling induced by mutation of a CNS-specific tRNA causes neurodegeneration. Science. 345 (6195), 455-459 (2014).
  19. Petersen, C. P., Bordeleau, M. E., Pelletier, J., Sharp, P. A. Short RNAs repress translation after initiation in mammalian cells. Molecular Cell. 21 (4), 533-542 (2006).
  20. Juntawong, P., Girke, T., Bazin, J., Bailey-Serres, J. Translational dynamics revealed by genome-wide profiling of ribosome footprints in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 111 (1), E203-E212 (2014).
  21. Bunnik, E. M., et al. Polysome profiling reveals translational control of gene expression in the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Genome Biology. 14 (11), R128 (2013).
  22. De Gaudenzi, J. G., Noe, G., Campo, V. A., Frasch, A. C., Cassola, A. Gene expression regulation in trypanosomatids. Essays in Biochemistry. 51, 31-46 (2011).
  23. Alves, L. R., Goldenberg, S. RNA-binding proteins related to stress response and differentiation in protozoa. World Journal of Biological Chemistry. 7 (1), 78-87 (2016).
  24. De Pablos, L. M., Ferreira, T. R., Walrad, P. B. Developmental differentiation in Leishmania lifecycle progression: post-transcriptional control conducts the orchestra. Current Opinions in Microbiology. 34, 82-89 (2016).
  25. Soto, M., et al. Cell-cycle-dependent translation of histone mRNAs is the key control point for regulation of histone biosynthesis in Leishmania infantum. Biochemical Journal. 379, 617-625 (2004).
  26. McNicoll, F., et al. Distinct 3 ‘-untranslated region elements regulate stage-specific mRNA accumulation and translation in Leishmania. Journal of Biological Chemistry. 280 (42), 35238-35246 (2005).
  27. Folgueira, C., et al. The translational efficiencies of the two Leishmania infantum HSP70 mRNAs, differing in their 3 ‘-untranslated regions, are affected by shifts in the temperature of growth through different mechanisms. Journal of Biological Chemistry. 280 (42), 35172-35183 (2005).
  28. Dumas, C., Chow, C., Muller, M., Papadopoulou, B. A novel class of developmentally regulated noncoding RNAs in Leishmania. Eukaryotic Cell. 5 (12), 2033-2046 (2006).
  29. Kapler, G. M., Coburn, C. M., Beverley, S. M. Stable transfection of the human parasite Leishmania major delineates a 30-kilobase region sufficient for extrachromosomal replication and expression. Molecular Cell Biology. 10 (3), 1084-1094 (1990).
  30. Karamyshev, A. L., Johnson, A. E. Selective SecA association with signal sequences in ribosome-bound nascent chains: a potential role for SecA in ribosome targeting to the bacterial membrane. Journal of Biological Chemistry. 280 (45), 37930-37940 (2005).
  31. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
  32. Panda, A. C., Martindale, J. L., Gorospe, M. Polysome Fractionation to Analyze mRNA Distribution Profiles. Bio Protocols. 7 (3), (2017).
  33. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular Cloning. A Laboratory Manual. , (1989).
  34. Patrick, A. E., Karamyshev, A. L., Millen, L., Thomas, P. J. Alteration of CFTR transmembrane span integration by disease-causing mutations. Molecular Biology of the Cell. 22 (23), 4461-4471 (2011).
  35. Kleizen, B., van Vlijmen, T., de Jonge, H. R., Braakman, I. Folding of CFTR is predominantly cotranslational. Molecular Cell. 20 (2), 277-287 (2005).
  36. van den Elzen, A. M., Schuller, A., Green, R., Seraphin, B. Dom34-Hbs1 mediated dissociation of inactive 80S ribosomes promotes restart of translation after stress. EMBO Journal. 33 (3), 265-276 (2014).
  37. Morita, M., et al. mTOR Controls Mitochondrial Dynamics and Cell Survival via MTFP1. Molecular Cell. 67 (6), 922-935 (2017).
  38. Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
check_url/kr/57600?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Karamysheva, Z. N., Tikhonova, E. B., Grozdanov, P. N., Huffman, J. C., Baca, K. R., Karamyshev, A., Denison, R. B., MacDonald, C. C., Zhang, K., Karamyshev, A. L. Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis. J. Vis. Exp. (134), e57600, doi:10.3791/57600 (2018).

View Video