Summary

Polysome التنميط في الليشمانياوالخلايا البشرية والخصية الماوس

Published: April 08, 2018
doi:

Summary

والهدف العام لأسلوب التنميط polysome تحليل النشاط متعدية الجنسيات مرناس الفردية أو مرناس الترنسكربيتوم خلال تخليق البروتين. الأسلوب مهم لدراسات البروتين التوليف تنظيم وتفعيل الترجمة والقمع في الصحة والأمراض البشرية المتعددة.

Abstract

تعبير البروتين المناسبة في الوقت المناسب وفي المبالغ الصحيحة التي هي أساس وظيفة الخلية الطبيعية والبقاء على قيد الحياة في بيئة سريعة التغير. لفترة طويلة، يهيمن عليها البحوث على المستوى النسخي دراسات التعبير الجيني. ومع ذلك، مستويات مستقرة مرناس ترتبط أيضا بإنتاج البروتين، وطواعية مرناس يختلف اختلافاً كبيرا تبعاً للظروف. في بعض الكائنات، مثل طفيلي الليشمانيا، ينظم التعبير البروتين معظمها على مستوى متعدية الجنسيات. أظهرت الدراسات الأخيرة أن التقلبات ترجمة البروتين يرتبط بالسرطان، والايض والأعصاب وغيرها من الأمراض البشرية. Polysome التنميط وسيلة قوية لدراسة تنظيم ترجمة البروتين. أنها تسمح لقياس حالة متعدية الجنسيات مرناس الفردية أو دراسة الترجمة على نطاق الجينوم. أساس هذا الأسلوب هو فصل polysomes وريبوسوم، والوحدات الفرعية ومرناس الحرة أثناء الطرد المركزي من هيولى من خلال تدرج سكروز. نقدم هنا، بوليسومي عالمي تنميط بروتوكول يستخدم في ثلاثة نماذج مختلفة–طفيل ليشمانيا كبيرة، استزراع الخلايا البشرية والأنسجة الحيوانية. ليشمانيا الخلايا تنمو بحرية في التعليق وتنمو الخلايا البشرية المستزرعة في أحادي الطبقة ملتصقة، بينما يمثل الخصية الماوس عينة أنسجة حيوانية. وهكذا، التقنية تتكيف مع كل مصدر من هذه المصادر. ويتضمن البروتوكول المتعلق بتحليل الكسور بوليسومال الكشف عن مستويات مرناً الفردية التي RT-قبكر، البروتينات لطخة غربية والتحليل للكشف الريباسي بالتفريد. الأسلوب يمكن تمديد دراسة رابطة مرناس مع الريبوسوم على مستوى الترنسكربيتوم بتسلسل الحمض النووي الريبي العميق وتحليل البروتينات المرتبطة الريبوسوم بالتحليل الطيفي الشامل للكسور. الأسلوب يمكن تعديلها بسهولة للنماذج البيولوجية الأخرى.

Introduction

ويسيطر تنظيم التعبير الجيني في الخلايا آليات النسخي وبوسترانسكريبشونال وبوستترانسلاشونال. السلف في تسلسل الحمض النووي الريبي عميقة تسمح دراسة مستويات مرناً مستقرة على نطاق الجينوم بمستوى لم يسبق له مثيل. ومع ذلك، أظهرت النتائج الأخيرة أن مستوى مرناً حالة ثابتة لا يرتبط دائماً بإنتاج البروتين1،2. مصير نسخة فردية معقدة جداً ويعتمد على عوامل كثيرة مثل المحفزات الداخلية والخارجية، والإجهاد، إلخ. تنظيم التعبير الجيني خلال تخليق البروتين يوفر طبقة أخرى من التعبير التحكم اللازمة لاستجابة سريعة في الظروف المتغيرة. بوليسومي (أو “بوليريبوسومي”) التنميط، والانفصال، والتصور بنشاط ترجمة ريبوسوم، وسيلة قوية لدراسة تنظيم تخليق البروتين. وعلى الرغم من تطبيقاته التجريبية الأولى ظهرت في الستينات3، polysome التنميط حاليا واحدة من التقنيات الأكثر أهمية في البروتين ترجمة الدراسات4. يمكن ترجمة مرناس واحدة من الريبوسوم واحد أو أكثر مما يؤدي إلى تشكيل بوليسومي. يمكن أن توقف المحاضر في ريبوسوم مع سيكلوهيكسيميدي5 ويمكن فصل مرناس التي تحتوي على أرقام مختلفة من بوليسوميس عملية تجزئة بوليسومي بواسطة السكروز تنبيذ فائق التدرج6،7 , 8 , 9-يسمح تحليل الحمض النووي الريبي للكسور بوليسومال ثم قياس التغيرات في الدول المتعدية في مرناس الفردية على نطاق الجينوم، وخلال مختلف الظروف الفسيولوجية4،7، 10-الأسلوب قد استخدمت أيضا لتكشف عن أدوار 5 ‘UTR و 3’ UTR تسلسل في السيطرة على مرناً طواعية11، ودراسة دور ميرناس في القمع متعدية12، كشف العيوب في الريبوسوم نشوء حيوي13 ، وفهم دور البروتينات المرتبطة الريبوسوم مع الأمراض التي تصيب الإنسان14،15. خلال العقد الماضي، برز دور متنام لتنظيم التعبير الجيني أثناء الترجمة أن يوضح أهميتها في الأمراض التي تصيب الإنسان. دليل مراقبة متعدية الجنسيات في السرطان، الأيضية وأمراض الأعصاب هو الساحقة15،16،،من1718. على سبيل المثال، يسهم في التقلبات eIF4E-تعتمد على مراقبة متعدية الجنسيات ذات الصلة بالتوحد في العجز15 وفمرب وتشارك في المماطلة من ريبوسوم في مرناس مرتبطة بالتوحد14. وهكذا، التنميط بوليسومال أداة هامة جداً لدراسة العيوب في التنظيم متعدية الجنسيات في العديد من الأمراض البشرية.

تحليل البروتين الكسور بوليسومال تحت ظروف فسيولوجية مختلفة يشرح وظيفة العوامل المرتبطة ريبوسوم أثناء الترجمة. وقد استخدمت تقنية polysome التنميط في العديد من الأنواع بما في ذلك الخميرة وخلايا الثدييات والنباتات والبروتوزوا10،19،،من2021. معرض الطفيليات الأوالي مثل المثقبيات و ليشمانيا التحكم النسخي محدودة للتعبير الجيني. وتنظم على الجينوم في مجموعات الجينات بوليسيسترونيك التي تفتقر إلى النسخ ينظم مروج22. بدلاً من ذلك، التعبير الجيني إنمائية يتم التحكم في الغالب على مستوى الترجمة البروتين والاستقرار مرناً في مثقبيات الأنواع23،24. ولذلك، فهم التحكم متعدية الجنسيات في غياب تنظيم النسخي أهمية خاصة بالنسبة لهذه الكائنات. التنميط بوليسومال أداة قوية لدراسة بوسترانسكريبشونال تنظيم التعبير الجيني في ليشمانيا25،26،،من2728.

التقدم الذي أحرز مؤخرا في الكشف عن المستويات الفردية مرناس ريال مرة PCR الكمي (RT-qPCR) وكامل الترنسكربيتوم بتسلسل الجيل القادم، فضلا عن التكنولوجيات البروتيوميات، يجلب القرار ومزايا التنميط بوليسومال إلى مستوى جديد. استخدام هذه الأساليب يمكن تمديد بتحليل للكسور بوليسومال الفردية بتسلسل الحمض النووي الريبي العميقة جنبا إلى جنب مع تحليل البروتين لرصد حالة متعدية الجنسيات من الخلايا في نطاق الجينوم. وهذا ما يسمح تحديد اللاعبين جزيئية جديدة تنظم الترجمة تحت مختلف الظروف الفسيولوجية والمرضية. نقدم هنا، بوليسومي عالمي التنميط بروتوكول يستخدم في ثلاثة نماذج مختلفة: طفيل ليشمانيا كبيرةومثقف الخلايا البشرية، والأنسجة الحيوانية. نقدم المشورة في إعداد ليساتيس الخلية من الكائنات المختلفة، والاستفادة المثلى شروط التدرج واختيار مثبطات رناسي وتطبيق قبكر RT ولطخة غربية والتفريد الحمض النووي الريبي لتحليل الكسور بوليسومي في هذه الدراسة.

Protocol

وأجريت جميع علاجات الحيوانات والتعامل مع الأنسجة التي تم الحصول عليها في الدراسة وفقا للبروتوكولات التي وافقت عليها لجنة الاستخدام في مركز العلوم تكساس تكنولوجيا جامعة الصحة وفقا للمعاهد الوطنية لرعاية الحيوان المؤسسية الإرشادات الصحية رعاية الحيوان، رقم بروتوكول 96005. الرجاء التضحية ا…

Representative Results

في هذه الدراسة، يصف لنا تطبيق أسلوب التنميط بوليسومال إلى ثلاثة مصادر مختلفة: الطفيلية ليشمانيا كبيرةومثقف الخلايا البشرية والخصية الماوس. ليشمانيا الخلايا تنمو بحرية في وسائل الإعلام السائلة في التعليق وتنمو الخلايا البشرية المستزرعة في أحادي الطبقة ملتصقة…

Discussion

تجزئة بوليسومي بالتدرج السكروز جنبا إلى جنب مع الجيش الملكي النيبالي، وتحليل البروتين الكسور وسيلة قوية لتحليل حالة متعدية الجنسيات مرناس الفردية أو ترانسلاتومي كله، فضلا عن أدوار العوامل البروتين تنظم متعدية الجنسيات إليه خلال حالة فيزيولوجية أو المرض العادي. التنميط بوليسومال وتقني?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

يشكر المؤلفون لي تشينغ للمساعدة في تسجيل الصوت. البحث تدعمها أموال بدء التشغيل من تكساس تكنولوجيا جامعة مركز علوم الصحة ومن مركز التميز “علم الأعصاب متعدية الجنسيات” والمداواة (كتنت) منح 2017 PN-كتنت-05 “أخرجدهو” A.L.K.؛ في جزء من المعاهد الوطنية للصحة منحة R01AI099380 هوفمان K.Z. جيمس جيم وباكا ر. كريستين العلماء سيسير (مركز “التكامل لوقف” التعليم والبحوث) وكانت مدعومة البرنامج.

Materials

Instruments:
Gradient master Biocomp Instruments Inc. 108
Piston Gradient Fractionator Biocomp Instruments Inc. 152
Fraction collector Gilson, Inc. FC203B
NanoDrop One Thermo Scientific NanoDrop One
Nikon inverted microscope Nikon ECLIPSE Ts2-FL/Ts2
2720 Thermal Cycler Applied Biosystems by Life Technologies 4359659
CO2 incubator Panasonic Healthcare Co. MCO-170A1CUV
HERATHERM incubator Thermo Scientific 51028063
Biological Safety Cabinet, class II, type A2 NuAire Inc. NU-543-400
Revco freezer Revco Technologies ULT1386-5-D35
Beckman L8-M Ultracentifuge Beckman Coulter L8M-70
Centrifuge Eppendorf 5810R
Centrifuge Eppendorf 5424
Ultracentrifuge Rotor SW41 Beckman Coulter 331362
Swing-bucket rotor Eppendorf A-4-62
Fixed angle rotor Eppendorf F-45-30-11
Quant Studio 12K Flex Real-Time PCR machine 285880228 Applied Biosystems by life technologies 4470661
TC20 Automated cell counter Bio-Rad 145-0102
Hemacytometer Hausser Scientific 02-671-51B
Software 
Triax software  Biocomp Instruments Inc.
Materials:
Counting slides, dual chamber for cell counter Bio-Rad 145-0011
1.5 mL microcentrifuge tube USA Scientific 1615-5500
Open-top polyclear centrifuge tubes, (14 mm x 89 mm) Seton Scientific 7030
Syringe, 5 mL BD 309646
BD Syringe 3 mL23 Gauge 1 Inch Needle BD 10020439
Nunclon Delta Surface plate, 14 cm Thermo Scientific 168381
Nunclon Delta Surface plate, 9 cm Thermo Scientific 172931
Nalgene rapid-flow 90mm filter unit, 500 mL, 0.2 aPES Thermo Scientific 569-0020
BioLite 75 cm3 flasks Thermo Scientific 130193
Nunc 50 mL conical centrifuge tubes Thermo Scientific 339653
Chemicals:
Trizol LS Ambion by Life Technologies 10296028
HEPES Fisher Scientific BP310-500
Trizma base Sigma T1378-5KG
Dulbecco's Modified Eagle's Medium-high glucose (DMEM) Sigma D6429-500ML
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F0926-50ML
Penicillin-Streptomycin (P/S) Sigma P0781-100ML
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-019
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) Sigma D8537-500ML
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2x6H2O) Acros Organics AC413415000
Potassium Chloride (KCl) Sigma P9541-500G
Nonidet P 40 (NP-40) Fluka (Sigma-Aldrich) 74385
Recombinant Rnasin Ribonuclease Inhibitor Promega N2511
Heparin sodium salt Sigma H3993-1MU
cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitors Roche Diagnostics 11836170001
Glycogen Thermo Scientific R0551
Water Sigma W4502-1L
Cycloheximide Sigma C7698-1G
Chloroform Fisher Scientific 194002
Dithiotreitol (DTT) Fisher Scientific BP172-5
Ethidium Bromide Fisher Scientific BP-1302-10
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium dehydrate (EDTA) Fisher Scientific S316-212
Optimem Life Technologies 22600050
Puromycin dihydrochloride Sigma P8833-100MG
Sucrose Fisher Scientific S5-3KG
Trypsin-EDTA solution Sigma T4049-100ML
Hgh Capacity cDNA Reverse Transcriptase Kit Applied Biosystems by life technologies 4368814
Power SYBR Green PCR Master Mix Applied Biosystems by life technologies 4367659
HCl Fisher Scientific A144SI-212
Isopropanol Fisher Scientific BP26324
Potassium Hydroxide (KOH) Sigma 221473-500G
Anti-RPL11 antibody Abcam ab79352
Ribosomal protein S6 (C-8) antibody Santa Cruz Biotechnology Inc. sc-74459
1xM199 Sigma M0393-10X1L
Lithium cloride Sigma L-9650
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific D128-500
Gel Loading Buffer II Thermo Scientific AM8546G
UltraPure Agarose Thermo Scientific 16500-100
Trichloracetic acid (TCA) Fisher Scientific A322-100
SuperSignal West Pico PLUS chemiluminescent substrate Thermo Scientific 34580
Formaldehyde Fisher Scientific BP531-500
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Sigma L5750-1KG
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Sigma P7626-5G
RNeasy Mini kit Qiagen 74104
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) Sigma A1852-1VL
Cytosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (CTP) Sigma C1506-250MG
Uridine 5'-triphosphate trisodium salt hydrate (UTP) Sigma U6625-100MG
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate (GTP) Sigma G8877-250MG
SP6 RNA Polymerase NEB M0207S
Pyrophoshatase Sigma I1643-500UN
Spermidine Sigma S0266-1G

References

  1. Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
  2. Capewell, P., et al. Regulation of Trypanosoma brucei Total and Polysomal mRNA during Development within Its Mammalian Host. PLoS One. 8 (6), e67069 (2013).
  3. Warner, J. R., Knopf, P. M., Rich, A. A multiple ribosomal structure in protein synthesis. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 49, 122-129 (1963).
  4. Piccirillo, C. A., Bjur, E., Topisirovic, I., Sonenberg, N., Larsson, O. Translational control of immune responses: from transcripts to translatomes. Nature Immunology. 15 (6), 503-511 (2014).
  5. Ennis, H. L., Lubin, M. Cycloheximide: Aspects of Inhibition of Protein Synthesis in Mammalian Cells. Science. 146 (3650), 1474-1476 (1964).
  6. Masek, T., Valasek, L., Pospisek, M. Polysome analysis and RNA purification from sucrose gradients. Methods in Molecular Biology. 703, 293-309 (2011).
  7. Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. Journal of Visualized Experiments. (87), (2014).
  8. Zuccotti, P., Modelska, A. Studying the Translatome with Polysome Profiling. Methods in Molecular Biology. 1358, 59-69 (2016).
  9. Chasse, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Research. 45 (3), e15 (2017).
  10. Arava, Y., et al. Genome-wide analysis of mRNA translation profiles in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 100 (7), 3889-3894 (2003).
  11. Gandin, V., et al. nanoCAGE reveals 5′ UTR features that define specific modes of translation of functionally related MTOR-sensitive mRNAs. Genome Research. 26 (5), 636-648 (2016).
  12. Bazzini, A. A., Lee, M. T., Giraldez, A. J. Ribosome profiling shows that miR-430 reduces translation before causing mRNA decay in zebrafish. Science. 336 (6078), 233-237 (2012).
  13. Zanchin, N. I., Goldfarb, D. S. Nip7p interacts with Nop8p, an essential nucleolar protein required for 60S ribosome biogenesis, and the exosome subunit Rrp43p. Molecular Cell Biology. 19 (2), 1518-1525 (1999).
  14. Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146 (2), 247-261 (2011).
  15. Gkogkas, C. G., et al. Autism-related deficits via dysregulated eIF4E-dependent translational control. Nature. 493 (7432), 371-377 (2013).
  16. Robichaud, N., Sonenberg, N. Translational control and the cancer cell response to stress. Curr Opin Cell Biol. 45, 102-109 (2017).
  17. Gordon, B. S., Kelleher, A. R., Kimball, S. R. Regulation of muscle protein synthesis and the effects of catabolic states. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 45 (10), 2147-2157 (2013).
  18. Ishimura, R., et al. RNA function. Ribosome stalling induced by mutation of a CNS-specific tRNA causes neurodegeneration. Science. 345 (6195), 455-459 (2014).
  19. Petersen, C. P., Bordeleau, M. E., Pelletier, J., Sharp, P. A. Short RNAs repress translation after initiation in mammalian cells. Molecular Cell. 21 (4), 533-542 (2006).
  20. Juntawong, P., Girke, T., Bazin, J., Bailey-Serres, J. Translational dynamics revealed by genome-wide profiling of ribosome footprints in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 111 (1), E203-E212 (2014).
  21. Bunnik, E. M., et al. Polysome profiling reveals translational control of gene expression in the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Genome Biology. 14 (11), R128 (2013).
  22. De Gaudenzi, J. G., Noe, G., Campo, V. A., Frasch, A. C., Cassola, A. Gene expression regulation in trypanosomatids. Essays in Biochemistry. 51, 31-46 (2011).
  23. Alves, L. R., Goldenberg, S. RNA-binding proteins related to stress response and differentiation in protozoa. World Journal of Biological Chemistry. 7 (1), 78-87 (2016).
  24. De Pablos, L. M., Ferreira, T. R., Walrad, P. B. Developmental differentiation in Leishmania lifecycle progression: post-transcriptional control conducts the orchestra. Current Opinions in Microbiology. 34, 82-89 (2016).
  25. Soto, M., et al. Cell-cycle-dependent translation of histone mRNAs is the key control point for regulation of histone biosynthesis in Leishmania infantum. Biochemical Journal. 379, 617-625 (2004).
  26. McNicoll, F., et al. Distinct 3 ‘-untranslated region elements regulate stage-specific mRNA accumulation and translation in Leishmania. Journal of Biological Chemistry. 280 (42), 35238-35246 (2005).
  27. Folgueira, C., et al. The translational efficiencies of the two Leishmania infantum HSP70 mRNAs, differing in their 3 ‘-untranslated regions, are affected by shifts in the temperature of growth through different mechanisms. Journal of Biological Chemistry. 280 (42), 35172-35183 (2005).
  28. Dumas, C., Chow, C., Muller, M., Papadopoulou, B. A novel class of developmentally regulated noncoding RNAs in Leishmania. Eukaryotic Cell. 5 (12), 2033-2046 (2006).
  29. Kapler, G. M., Coburn, C. M., Beverley, S. M. Stable transfection of the human parasite Leishmania major delineates a 30-kilobase region sufficient for extrachromosomal replication and expression. Molecular Cell Biology. 10 (3), 1084-1094 (1990).
  30. Karamyshev, A. L., Johnson, A. E. Selective SecA association with signal sequences in ribosome-bound nascent chains: a potential role for SecA in ribosome targeting to the bacterial membrane. Journal of Biological Chemistry. 280 (45), 37930-37940 (2005).
  31. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
  32. Panda, A. C., Martindale, J. L., Gorospe, M. Polysome Fractionation to Analyze mRNA Distribution Profiles. Bio Protocols. 7 (3), (2017).
  33. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular Cloning. A Laboratory Manual. , (1989).
  34. Patrick, A. E., Karamyshev, A. L., Millen, L., Thomas, P. J. Alteration of CFTR transmembrane span integration by disease-causing mutations. Molecular Biology of the Cell. 22 (23), 4461-4471 (2011).
  35. Kleizen, B., van Vlijmen, T., de Jonge, H. R., Braakman, I. Folding of CFTR is predominantly cotranslational. Molecular Cell. 20 (2), 277-287 (2005).
  36. van den Elzen, A. M., Schuller, A., Green, R., Seraphin, B. Dom34-Hbs1 mediated dissociation of inactive 80S ribosomes promotes restart of translation after stress. EMBO Journal. 33 (3), 265-276 (2014).
  37. Morita, M., et al. mTOR Controls Mitochondrial Dynamics and Cell Survival via MTFP1. Molecular Cell. 67 (6), 922-935 (2017).
  38. Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).

Play Video

Cite This Article
Karamysheva, Z. N., Tikhonova, E. B., Grozdanov, P. N., Huffman, J. C., Baca, K. R., Karamyshev, A., Denison, R. B., MacDonald, C. C., Zhang, K., Karamyshev, A. L. Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis. J. Vis. Exp. (134), e57600, doi:10.3791/57600 (2018).

View Video