Polysome में profile Leishmania, मानव कोशिकाओं और माउस वृषण
Summary
polysome रूपरेखा तकनीक का समग्र लक्ष्य प्रोटीन संश्लेषण के दौरान व्यक्तिगत mRNAs या transcriptome mRNAs के शोधों की गतिविधि का विश्लेषण है । विधि प्रोटीन संश्लेषण विनियमन, अनुवाद सक्रियण और स्वास्थ्य और कई मानव रोगों में दमन के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है ।
Abstract
सही समय पर उचित प्रोटीन अभिव्यक्ति और सही मात्रा में सामांय कोशिका समारोह और एक तेजी से बदलते वातावरण में अस्तित्व का आधार है । काफी समय से transcriptional स्तर पर शोध से जीन एक्सप्रेशन स्टडीज हावी रहीं । हालांकि, mRNAs के स्थिर राज्य स्तर प्रोटीन उत्पादन के साथ अच्छी तरह से सहसंबंधी नहीं है, और mRNAs के अनुवाद बहुत शर्तों के आधार पर बदलता है । कुछ जीवों में, परजीवी Leishmaniaकी तरह, प्रोटीन अभिव्यक्ति ज्यादातर शोधों के स्तर पर विनियमित है । हाल के अध्ययनों में यह दर्शाया गया है कि प्रोटीन अनुवाद dysregulation कैंसर, चयापचय, neurodegenerative और अन्य मानव रोगों के साथ जुड़ा हुआ है । Polysome profiling प्रोटीन अनुवाद विनियमन अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका है । यह व्यक्तिगत mRNAs की शोधों की स्थिति को मापने या एक जीनोम चौड़ा पैमाने पर अनुवाद की जांच करने के लिए अनुमति देता है । इस तकनीक के आधार polysomes, ribosomes, उनकी उपइकाई और एक lysate ढाल के माध्यम से एक cytoplasmic सुक्रोज के केंद्रापसारक के दौरान मुक्त mRNAs की जुदाई है । यहां, हम तीन अलग मॉडल-परजीवी Leishmania प्रमुख, संस्कृतिपूर्ण मानव कोशिकाओं और पशुओं के ऊतकों पर इस्तेमाल एक सार्वभौमिक polysome profiling प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । Leishmania कोशिकाओं को स्वतंत्र रूप से निलंबन और संस्कृति मानव कोशिकाओं अनुयाई monolayer में बढ़ने में वृद्धि, जबकि माउस वृषण एक पशु ऊतक नमूने का प्रतिनिधित्व करता है । इस प्रकार, तकनीक इन स्रोतों के सभी के लिए अनुकूलित है । polysomal अंशों के विश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल RT-qPCR द्वारा व्यक्तिगत mRNA स्तर का पता लगाना भी शामिल है, पश्चिमी दाग और RNAs द्वारा राइबोसोमल ट्रो के विश्लेषण द्वारा प्रोटीन. विधि transcriptome स्तर पर ribosome के साथ गहरी आरएनए-seq और ribosome-जुड़े प्रोटीन के विश्लेषण द्वारा अंशों के जन स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा एक के साथ mRNAs एसोसिएशन की परीक्षा द्वारा आगे बढ़ाया जा सकता है. विधि आसानी से अंय जैविक मॉडलों के लिए समायोजित किया जा सकता है ।
Introduction
कोशिकाओं में जीन अभिव्यक्ति का नियमन transcriptional, posttranscriptional और posttranslational तंत्र द्वारा नियंत्रित होता है. गहरी आरएनए अनुक्रमण में अग्रिम एक अभूतपूर्व स्तर पर एक जीनोम चौड़ा पैमाने पर स्थिर राज्य mRNA के स्तर के अध्ययन की अनुमति देते हैं । हालांकि, हाल के निष्कर्षों से पता चला है कि स्थिर राज्य mRNA स्तर हमेशा प्रोटीन उत्पादन1,2के साथ सहसंबंधी नहीं है । एक व्यक्ति की प्रतिलिपि के भाग्य बहुत जटिल है और आंतरिक/बाहरी उत्तेजनाओं, तनाव, आदिजैसे कई कारकों पर निर्भर करता है । प्रोटीन संश्लेषण के दौरान जीन अभिव्यक्ति का विनियमन बदलती परिस्थितियों में एक तेजी से प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक अभिव्यक्ति नियंत्रण की एक और परत प्रदान करता है । Polysome (या “polyribosome”) रूपरेखा, जुदाई और सक्रिय रूप से अनुवाद ribosomes के दृश्य, एक शक्तिशाली करने के लिए प्रोटीन संश्लेषण के विनियमन अध्ययन विधि है । हालांकि, इसके पहले प्रयोगात्मक आवेदन 1960 के दशक में3दिखाई दिया, polysome profiling वर्तमान में प्रोटीन अनुवाद अध्ययन में सबसे महत्वपूर्ण तकनीकों में से एक है4। एकल mRNAs एक polysome के गठन के लिए अग्रणी एक से अधिक ribosome द्वारा अनुवाद किया जा सकता है । टेप cycloheximide के साथ ribosomes पर स्टाल लगाया जा सकता है5 और polysomes के विभिंन नंबरों युक्त mRNAs polysome ढाल सुक्रोज द्वारा ultracentrifugation अंश की प्रक्रिया में अलग किया जा सकता है6,7 , 8 , 9. आरएनए polysomal अंशों का विश्लेषण तो जीनोम पर व्यक्तिगत mRNAs के शोधों राज्यों में परिवर्तन की व्यापक पैमाने पर और विभिन्न शारीरिक स्थितियों के दौरान माप की अनुमति देता है4,7, 10. विधि भी mRNA अनुवादता11के नियंत्रण में 5 ‘ UTR और 3 ‘ UTR अनुक्रम की भूमिकाओं को प्रकट करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, शोधों दमन में miRNAs की भूमिका की जांच करें12, ribosome में उजागर दोष13 , और मानव रोगों14,15के साथ ribosome-जुड़े प्रोटीन की भूमिका को समझते हैं । पिछले दशक के दौरान, अनुवाद के दौरान जीन अभिव्यक्ति के विनियमन के लिए एक बढ़ती हुई भूमिका उभरी है जो मानव रोगों में इसके महत्व को दर्शाती है । कैंसर, चयापचय और neurodegenerative रोगों में अनुवाद नियंत्रण के लिए सबूत भारी है15,16,17,18। उदाहरण के लिए, eIF4E के dysregulation-निर्भर शोधों नियंत्रण आत्मकेंद्रित संबंधित घाटे के लिए योगदान देता है15 और FMRP autism से जुड़े mRNAs पर ribosomes के स्टालिंग में शामिल है14। इस प्रकार, polysomal profiling एक बहुत ही महत्वपूर्ण उपकरण के लिए कई मानव रोगों में अनुवाद विनियमन में दोषों का अध्ययन है ।
विभिन्न शारीरिक स्थितियों के अंतर्गत polysomal अंशों का प्रोटीन विश्लेषण अनुवाद के दौरान ribosomes से जुड़े कारकों के कार्य को विच्छेदित करते हैं । polysome profiling तकनीक खमीर, स्तनधारी कोशिकाओं, पौधों, और प्रोटोजोआ10,19,20,21सहित कई प्रजातियों में इस्तेमाल किया गया है । प्रोटोजोआ की तरह परजीवी Trypanosoma और Leishmania प्रदर्शन सीमित जीन अभिव्यक्ति की transcriptional नियंत्रण । उनके जीनोम polycistronic जीन क्लस्टर कि कमी प्रमोटर विनियमित प्रतिलेखन22में आयोजित कर रहे हैं । इसके बजाय, विकास जीन अभिव्यक्ति मुख्य रूप से trypanosomatid प्रजातियों में प्रोटीन अनुवाद और mRNA स्थिरता के स्तर पर नियंत्रित किया जाता है23,24। इसलिए, transcriptional विनियमन के अभाव में शोधों के नियंत्रण की समझ इन जीवों के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है । Polysomal profile Leishmania25,26,27,28में जीन की अभिव्यक्ति के posttranscriptional विनियमन का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है ।
वास्तविक समय मात्रात्मक पीसीआर (RT-qPCR) और पूर्ण transcriptome द्वारा अगली पीढ़ी के अनुक्रमण, साथ ही प्रोटियोमिक् प्रौद्योगिकियों द्वारा व्यक्तिगत mRNAs स्तर का पता लगाने में हाल ही में प्रगति, संकल्प और एक नए स्तर के लिए polysomal profiling के लाभ लाता है । इन विधियों का उपयोग एक जीनोम चौड़ा पैमाने पर कोशिकाओं की शोधों की स्थिति पर नजर रखने के लिए proteomic विश्लेषण के साथ संयुक्त गहरी आरएनए अनुक्रमण द्वारा व्यक्तिगत polysomal भिन्नताओं के विश्लेषण द्वारा आगे बढ़ाया जा सकता है । यह विभिंन शारीरिक और रोग की स्थिति के तहत अनुवाद विनियमन नए आणविक खिलाड़ियों की पहचान की अनुमति देता है । यहां, हम तीन विभिंन मॉडलों पर इस्तेमाल एक सार्वभौमिक polysome profiling प्रोटोकॉल वर्तमान: परजीवी Leishmania प्रमुख, संस्कृतिपूर्ण मानव कोशिकाओं, और पशुओं के ऊतकों । हम विभिंन जीवों से सेल lysates की तैयारी पर सलाह पेश करते हैं, ढाल शर्तों का अनुकूलन, RNase अवरोधकों के विकल्प और आरटी के आवेदन-qPCR, पश्चिमी दाग और आरएनए ट्रो इस अध्ययन में polysome भागों का विश्लेषण करने के लिए ।
Protocol
Representative Results
Discussion
Polysome भिन्नीकरण के साथ संयुक्त आरएनए और अंशों के प्रोटीन विश्लेषण के साथ संयोजित एक शक्तिशाली विधि के लिए व्यक्तिगत mRNAs या पूरे translatome की शोधों की स्थिति का विश्लेषण के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रोटी?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों ऑडियो रिकॉर्डिंग के साथ मदद के लिए चिंग ली धंयवाद । अनुसंधान शुरू द्वारा समर्थित किया गया था निधियों से टेक्सास टेक विश्वविद्यालय स्वास्थ्य विज्ञान केंद्र और उत्कृष्टता के केंद्र द्वारा अनुवाद तंत्रिका विज्ञान और चिकित्सीय (CTNT) अनुदान PN-CTNT 2017-05 AKHRJDHW के लिए A.L.K.; K.Z. जेंस सी Huffman और िईद्भस्टेन आर Baca को NIH ग्रांट R01AI099380 द्वारा भाग में CISER थे (स्टेम शिक्षा और अनुसंधान के एकीकरण के लिए केंद्र) विद्वानों और कार्यक्रम द्वारा समर्थित थे ।
Materials
| Instruments: | ||
| Gradient master | Biocomp Instruments Inc. | 108 |
| Piston Gradient Fractionator | Biocomp Instruments Inc. | 152 |
| Fraction collector | Gilson, Inc. | FC203B |
| NanoDrop One | Thermo Scientific | NanoDrop One |
| Nikon inverted microscope | Nikon | ECLIPSE Ts2-FL/Ts2 |
| 2720 Thermal Cycler | Applied Biosystems by Life Technologies | 4359659 |
| CO2 incubator | Panasonic Healthcare Co. | MCO-170A1CUV |
| HERATHERM incubator | Thermo Scientific | 51028063 |
| Biological Safety Cabinet, class II, type A2 | NuAire Inc. | NU-543-400 |
| Revco freezer | Revco Technologies | ULT1386-5-D35 |
| Beckman L8-M Ultracentifuge | Beckman Coulter | L8M-70 |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 |
| Ultracentrifuge Rotor SW41 | Beckman Coulter | 331362 |
| Swing-bucket rotor | Eppendorf | A-4-62 |
| Fixed angle rotor | Eppendorf | F-45-30-11 |
| Quant Studio 12K Flex Real-Time PCR machine 285880228 | Applied Biosystems by life technologies | 4470661 |
| TC20 Automated cell counter | Bio-Rad | 145-0102 |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 02-671-51B |
| Software | ||
| Triax software | Biocomp Instruments Inc. | |
| Materials: | ||
| Counting slides, dual chamber for cell counter | Bio-Rad | 145-0011 |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | USA Scientific | 1615-5500 |
| Open-top polyclear centrifuge tubes, (14 mm x 89 mm) | Seton Scientific | 7030 |
| Syringe, 5 mL | BD | 309646 |
| BD Syringe 3 mL23 Gauge 1 Inch Needle | BD | 10020439 |
| Nunclon Delta Surface plate, 14 cm | Thermo Scientific | 168381 |
| Nunclon Delta Surface plate, 9 cm | Thermo Scientific | 172931 |
| Nalgene rapid-flow 90mm filter unit, 500 mL, 0.2 aPES | Thermo Scientific | 569-0020 |
| BioLite 75 cm3 flasks | Thermo Scientific | 130193 |
| Nunc 50 mL conical centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339653 |
| Chemicals: | ||
| Trizol LS | Ambion by Life Technologies | 10296028 |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 |
| Trizma base | Sigma | T1378-5KG |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium-high glucose (DMEM) | Sigma | D6429-500ML |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F0926-50ML |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | Sigma | P0781-100ML |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Sigma | D8537-500ML |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2x6H2O) | Acros Organics | AC413415000 |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma | P9541-500G |
| Nonidet P 40 (NP-40) | Fluka (Sigma-Aldrich) | 74385 |
| Recombinant Rnasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2511 |
| Heparin sodium salt | Sigma | H3993-1MU |
| cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitors | Roche Diagnostics | 11836170001 |
| Glycogen | Thermo Scientific | R0551 |
| Water | Sigma | W4502-1L |
| Cycloheximide | Sigma | C7698-1G |
| Chloroform | Fisher Scientific | 194002 |
| Dithiotreitol (DTT) | Fisher Scientific | BP172-5 |
| Ethidium Bromide | Fisher Scientific | BP-1302-10 |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium dehydrate (EDTA) | Fisher Scientific | S316-212 |
| Optimem | Life Technologies | 22600050 |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma | P8833-100MG |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3KG |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T4049-100ML |
| Hgh Capacity cDNA Reverse Transcriptase Kit | Applied Biosystems by life technologies | 4368814 |
| Power SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems by life technologies | 4367659 |
| HCl | Fisher Scientific | A144SI-212 |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP26324 |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma | 221473-500G |
| Anti-RPL11 antibody | Abcam | ab79352 |
| Ribosomal protein S6 (C-8) antibody | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-74459 |
| 1xM199 | Sigma | M0393-10X1L |
| Lithium cloride | Sigma | L-9650 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 |
| Gel Loading Buffer II | Thermo Scientific | AM8546G |
| UltraPure Agarose | Thermo Scientific | 16500-100 |
| Trichloracetic acid (TCA) | Fisher Scientific | A322-100 |
| SuperSignal West Pico PLUS chemiluminescent substrate | Thermo Scientific | 34580 |
| Formaldehyde | Fisher Scientific | BP531-500 |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma | L5750-1KG |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626-5G |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma | A1852-1VL |
| Cytosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (CTP) | Sigma | C1506-250MG |
| Uridine 5'-triphosphate trisodium salt hydrate (UTP) | Sigma | U6625-100MG |
| Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate (GTP) | Sigma | G8877-250MG |
| SP6 RNA Polymerase | NEB | M0207S |
| Pyrophoshatase | Sigma | I1643-500UN |
| Spermidine | Sigma | S0266-1G |
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