Summary

リーシュ マニア、ひと細胞およびマウス精巣におけるプロファイリングをポリソーム

Published: April 08, 2018
doi:

Summary

ポリソーム プロファイリング技術の全体的な目標は、タンパク質合成時に個々 の mRNAs のトランスクリプトーム Mrna 翻訳活性の分析です。メソッドは、タンパク質合成の制御、翻訳活性化と健康と複数の人間の病気の抑制の研究にとって重要です。

Abstract

右金額は、適切なタイミングで適切なタンパク質発現正常な細胞機能と急速に変化する環境での生存の基礎であります。長い間、遺伝子発現研究は、転写レベルでの研究によって支配されていた。しかし、Mrna の定常状態レベルは蛋白質の生産と相関がない、Mrna の翻訳可能性は条件によって大きく異なります。リーシュ マニア原虫寄生虫のようないくつかの生物の蛋白質の表現は翻訳のレベルではほとんど規制されています。最近の研究は、その蛋白質の翻訳調節不全、代謝、がん、神経変性疾患や他の疾患に関連付けられて示した。ポリソームのプロファイリングは、タンパク質翻訳規則を研究する強力な方法です。それは個々 の mRNAs の並進状態を測定したり、ゲノム規模での翻訳を確認することができます。この手法の基本は、ポリソーム、リボソームのサブユニットと無料 Mrna 遠心分離、細胞質の中にショ糖密度勾配による溶解分離です。ユニバーサル ポリソーム プロファイル使用されるプロトコルで 3 つの異なるモデル原虫リーシュ マニア原虫、ひと培養細胞、動物組織を紹介します。リーシュ マニア原虫の細胞は懸濁液の自由に成長し、動物組織サンプルを表しますマウス精巣培養細胞付着性単分子膜の成長します。したがって、技術はこれらの源すべてに適応です。Polysomal 分画の分析のためのプロトコルには、個々 の mRNA のレベル Rt-qpcr、によってに、西部のしみとリボソーム Rna 電気泳動による解析によるタンパク質の検出が含まれています。メソッドは、分数の質量分析法による深い RNA シーケンスによってトランスクリプトームのレベルにリボソームの Mrna 協会の検討とリボソームのタンパク質の解析によってさらに拡張できます。このメソッドは、他の生物学的モデルに簡単に調整できます。

Introduction

細胞の遺伝子発現制御は、転写、転写、翻訳のメカニズムによって制御されます。ディープの RNA シーケンスの進歩は、前例のないレベルでゲノム スケールで定常状態の mRNA のレベルの研究を許可します。しかし、最近の知見は、定常 mRNA レベルがない、常にタンパク質生産1,2と相関を明らかにしました。個々 のトラン スクリプトの運命は非常に複雑な内部/外部刺激、ストレスなどのような多くの要因によって異なります。タンパク質の生合成遺伝子発現の調節は、状況の変化にすばやく応答するために必要な式コントロールの別の層を提供します。ポリソーム (または”polyribosome”) のプロファイリング、分離と積極的にリボソームの翻訳の可視化は、タンパク質合成の調節を研究する強力な方法です。最初の実験的応用は 1960 年代3に登場、ポリソームのプロファイリングは現在タンパク質翻訳研究4で最も重要なテクニックの 1 つ。単一の Mrna は、ポリソームの形成につながる 1 つ以上のリボソームで翻訳できます。成績証明書はシクロヘキシミド5リボソーム上停止することができ。、ショ糖勾配遠心6,7ポリソーム分別過程で Mrna はポリソームの別の番号を含むを分けることができます。,8,9. polysomal 分画の RNA 解析、により個々 の mRNAs の並進状態の変化の測定、ゲノム規模で、さまざまな生理的条件4,7,10. メソッドは、5′ UTR と 3′ UTR シーケンス mRNA 訳し11の制御の役割を明らかにする、翻訳抑制12の Mirna の役割を調べる、リボソーム生合成13 の欠陥を明らかにも使用されています、および人間の病気14,15にリボソーム蛋白質の役割を理解します。過去 10 年間の中には、ヒトの疾患におけるその重要性を示す翻訳中に遺伝子発現の役割の拡大が浮上しています。がん、代謝における翻訳調節と神経変性疾患のための証拠は、圧倒的な15,16,17,18です。EIF4E 依存翻訳調節の調節不全に貢献するたとえば、自閉症関連の赤字15と FMRP14自閉症にリンクされている Mrna にリボソームの失速に関与しています。したがって、polysomal プロファイルは、複数の人間の病気の翻訳制御の欠陥を研究する非常に重要なツールです。

Polysomal 分数別の生理学的条件下での蛋白質の解析は、翻訳中のリボソームと関連因子の関数を暴き出します。ポリソーム プロファイリング手法は、酵母、哺乳類細胞、植物、原生動物10,19,20,21など多くの種で使用されています。原虫トリパノソーマリーシュ マニアなどの遺伝子発現の転写調節機構限定展示します。そのゲノムはプロモーター規制転写22を持たないコードする遺伝子クラスターに分類されます。代わりに、発達の遺伝子発現は主にタンパク質翻訳およびトリパノソーマ科種23,24で mRNA の安定性のレベルで制御されます。したがって、転写制御の不在で並進制御の理解はこれらの有機体のため特に重要です。Polysomal ・ プロファイリングは、リーシュ マニア25,26,27,28遺伝子発現の転写後調節を研究する強力なツールです。

現実では個々 の mRNAs レベルの検出の最近の進歩は時間 (RT qPCR) の量的な PCR とプロテオミクス技術と同様、次世代シーケンシングによるトランスクリプトーム、解像度、新しいレベルに polysomal プロファイルの利点をもたらします。これらのメソッドの使用は、ディープの RNA シーケンス細胞ゲノム規模での並進状態を監視するプロテオーム解析の併用による個々 の polysomal 分画の解析によってさらに拡張できます。これは、異なる生理学的および病理学的条件の下で翻訳を調節する新規分子プレイヤーの識別できます。ここでは、提案する 3 つのモデルで使用されるプロトコルをプロファイリング ユニバーサル ポリソーム: 原虫リーシュ マニア原虫、培養細胞、動物組織。異なった有機体、勾配条件の最適化、RNase 阻害剤の選択と本研究でポリソーム分数を分析する RT qPCR、西部のしみ、RNA の電気泳動の適用からのセル lysates の準備でのアドバイスを紹介します。

Protocol

すべての動物の治療や研究で得られた組織の処理機関動物ケアおよび国立研究所に従ってテキサス工科大学健康科学センターで使用委員会によって承認されたプロトコルに従って行われました。健康家畜福祉ガイドライン、プロトコル番号 96005。脊椎動物を犠牲にし、機関動物ケアおよび使用委員会からガイドラインに従って組織を準備してください。このような委員会に欠けている、国立?…

Representative Results

この研究では、3 つの異なるソースの polysomal のプロファイリング技術の応用について述べる: 寄生リーシュ マニア原虫、培養ひと細胞およびマウス精巣。リーシュ マニア原虫の細胞は自由に懸濁液中の液体媒体の成長、ひと培養細胞はプレートに付着性単分子膜の成長し、マウス精巣組織サンプルを表します。メソッドは、懸濁液、組織、または別の?…

Discussion

ショ糖密度勾配によるポリソーム分別が RNA と結合し、タンパク質画分の分析は個々 の mRNAs または全体 translatome の並進状態だけでなく、並進を規定する蛋白質の要因の役割を分析するための強力な方法通常の生理や病気の状態の間に機械。Polysomal プロファイリングリーシュ マニア転写制御は主として不在、遺伝子発現制御が主に発生しますを含む trypanosomatids などの生物の翻訳制御?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者はチン ・ リーのオーディオ録音との助けをありがちましょう。テキサス工科大学医療科学センターからスタートアップ資金によって支えられたし、神経科学研究と治療 (CTNT) のための卓越性のセンター A.L.K.; に PN CTNT 2017-05 AKHRJDHW を与える研究NIH グラントによって部分的に K.Z. ジェームス c. ハフマンとクリステン ・ r ・ デバカ R01AI099380 CISER (幹統合教育研究センター) 学者、プログラムによってサポートされていました。

Materials

Instruments:
Gradient master Biocomp Instruments Inc. 108
Piston Gradient Fractionator Biocomp Instruments Inc. 152
Fraction collector Gilson, Inc. FC203B
NanoDrop One Thermo Scientific NanoDrop One
Nikon inverted microscope Nikon ECLIPSE Ts2-FL/Ts2
2720 Thermal Cycler Applied Biosystems by Life Technologies 4359659
CO2 incubator Panasonic Healthcare Co. MCO-170A1CUV
HERATHERM incubator Thermo Scientific 51028063
Biological Safety Cabinet, class II, type A2 NuAire Inc. NU-543-400
Revco freezer Revco Technologies ULT1386-5-D35
Beckman L8-M Ultracentifuge Beckman Coulter L8M-70
Centrifuge Eppendorf 5810R
Centrifuge Eppendorf 5424
Ultracentrifuge Rotor SW41 Beckman Coulter 331362
Swing-bucket rotor Eppendorf A-4-62
Fixed angle rotor Eppendorf F-45-30-11
Quant Studio 12K Flex Real-Time PCR machine 285880228 Applied Biosystems by life technologies 4470661
TC20 Automated cell counter Bio-Rad 145-0102
Hemacytometer Hausser Scientific 02-671-51B
Software 
Triax software  Biocomp Instruments Inc.
Materials:
Counting slides, dual chamber for cell counter Bio-Rad 145-0011
1.5 mL microcentrifuge tube USA Scientific 1615-5500
Open-top polyclear centrifuge tubes, (14 mm x 89 mm) Seton Scientific 7030
Syringe, 5 mL BD 309646
BD Syringe 3 mL23 Gauge 1 Inch Needle BD 10020439
Nunclon Delta Surface plate, 14 cm Thermo Scientific 168381
Nunclon Delta Surface plate, 9 cm Thermo Scientific 172931
Nalgene rapid-flow 90mm filter unit, 500 mL, 0.2 aPES Thermo Scientific 569-0020
BioLite 75 cm3 flasks Thermo Scientific 130193
Nunc 50 mL conical centrifuge tubes Thermo Scientific 339653
Chemicals:
Trizol LS Ambion by Life Technologies 10296028
HEPES Fisher Scientific BP310-500
Trizma base Sigma T1378-5KG
Dulbecco's Modified Eagle's Medium-high glucose (DMEM) Sigma D6429-500ML
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F0926-50ML
Penicillin-Streptomycin (P/S) Sigma P0781-100ML
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-019
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) Sigma D8537-500ML
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2x6H2O) Acros Organics AC413415000
Potassium Chloride (KCl) Sigma P9541-500G
Nonidet P 40 (NP-40) Fluka (Sigma-Aldrich) 74385
Recombinant Rnasin Ribonuclease Inhibitor Promega N2511
Heparin sodium salt Sigma H3993-1MU
cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitors Roche Diagnostics 11836170001
Glycogen Thermo Scientific R0551
Water Sigma W4502-1L
Cycloheximide Sigma C7698-1G
Chloroform Fisher Scientific 194002
Dithiotreitol (DTT) Fisher Scientific BP172-5
Ethidium Bromide Fisher Scientific BP-1302-10
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium dehydrate (EDTA) Fisher Scientific S316-212
Optimem Life Technologies 22600050
Puromycin dihydrochloride Sigma P8833-100MG
Sucrose Fisher Scientific S5-3KG
Trypsin-EDTA solution Sigma T4049-100ML
Hgh Capacity cDNA Reverse Transcriptase Kit Applied Biosystems by life technologies 4368814
Power SYBR Green PCR Master Mix Applied Biosystems by life technologies 4367659
HCl Fisher Scientific A144SI-212
Isopropanol Fisher Scientific BP26324
Potassium Hydroxide (KOH) Sigma 221473-500G
Anti-RPL11 antibody Abcam ab79352
Ribosomal protein S6 (C-8) antibody Santa Cruz Biotechnology Inc. sc-74459
1xM199 Sigma M0393-10X1L
Lithium cloride Sigma L-9650
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific D128-500
Gel Loading Buffer II Thermo Scientific AM8546G
UltraPure Agarose Thermo Scientific 16500-100
Trichloracetic acid (TCA) Fisher Scientific A322-100
SuperSignal West Pico PLUS chemiluminescent substrate Thermo Scientific 34580
Formaldehyde Fisher Scientific BP531-500
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Sigma L5750-1KG
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Sigma P7626-5G
RNeasy Mini kit Qiagen 74104
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) Sigma A1852-1VL
Cytosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (CTP) Sigma C1506-250MG
Uridine 5'-triphosphate trisodium salt hydrate (UTP) Sigma U6625-100MG
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate (GTP) Sigma G8877-250MG
SP6 RNA Polymerase NEB M0207S
Pyrophoshatase Sigma I1643-500UN
Spermidine Sigma S0266-1G

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Karamysheva, Z. N., Tikhonova, E. B., Grozdanov, P. N., Huffman, J. C., Baca, K. R., Karamyshev, A., Denison, R. B., MacDonald, C. C., Zhang, K., Karamyshev, A. L. Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis. J. Vis. Exp. (134), e57600, doi:10.3791/57600 (2018).

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