Polysome פרופיל לישמניה, תאים אנושיים, Testis העכבר
Summary
המטרה הכוללת של טכניקה פרופיל polysome הוא ניתוח של פעילות translational של הפרט mRNAs או transcriptome mRNAs במהלך סינתזת החלבון. השיטה זו חשוב ללימודים של רגולציה סינתזה של חלבון, הפעלת תרגום ודיכוי בריאות ומחלות האנושי מרובים.
Abstract
ביטוי חלבון הנכון בזמן הנכון, בכמות הנכונה היא הבסיס של תאים נורמליים פונקציה והישרדות בסביבה המשתנים במהירות. במשך זמן רב, המחקרים ביטוי גנים נשלטו על ידי מחקר על רמת גנים ברמת השעתוק. עם זאת, רמות מצב יציב mRNAs לא מתאימות היטב עם ייצור החלבון, translatability של mRNAs משתנה מאוד בהתאם לתנאים. אורגניזמים מסוימים, כמו טפיל לישמניה, הביטוי חלבון מוסדר בעיקר ברמת translational. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו ש-dysregulation תרגום החלבון הזה מזוהה עם סרטן, חילוף החומרים, ניווניות מחלות אנושיות אחרות. פרופיל polysome היא שיטה חזקה ללמוד תקנה תרגום החלבון. זה מאפשר למדוד את מצב translational mRNAs בודדים או לבחון תרגום בקנה מידה הגנום כולו. הבסיס של טכניקה זו היא ההפרדה polysomes, ריבוזומים, שלהם subunits, mRNAs חינם במהלך צנטריפוגה של cytoplasmic lysate דרך מעבר הדרגתי סוכרוז. כאן, אנו מציגים polysome אוניברסלי פרופיל פרוטוקול המשמש על שלושה דגמים שונים – טפיל לישמניה הגדולות, בתרבית תאים אנושיים ורקמות חיות. לישמניה תאים לגדול באופן חופשי ההשעיה, בתרבית תאים אנושיים לגדול חסיד טפט, בעוד העכבר testis מייצג של דגימת רקמה חיה. לכן, השיטה היא מותאם לכל אחד ממקורות אלה. הפרוטוקול עבור הניתוח של שברים polysomal כולל זיהוי של רמות ה-mRNA בודדות מאת RT-qPCR, חלבונים על ידי תספיג וניתוח של RNAs ribosomal על ידי אלקטרופורזה. השיטה ניתן להרחיב הלאה על ידי לספקטרומטרית מסות של השברים על ידי בחינת mRNAs שיוך הריבוזום ברמת transcriptome על ידי RNA עמוק-seq וניתוח של חלבונים הקשורים ריבוזום. השיטה ניתן להתאים בקלות למודלים ביולוגיים אחרים.
Introduction
בקרת גנים בתאים נשלטת על ידי גנים ברמת השעתוק, posttranscriptional ו- posttranslational. ההתקדמות רצף הרנ א עמוק לאפשר המחקר של מצב יציב רמות ה-mRNA בקנה מידה הגנום כולו ברמה חסרת תקדים. עם זאת, הממצאים האחרונים גילה כי רמת ה-mRNA מצב יציב לא תמיד לתאם עם חלבון ייצור1,2. גורלו של התעתיק בודדים מורכב מאוד, תלוי בגורמים רבים כמו גירויים פנימי/חיצוני, הלחץ, וכו ‘. בקרת גנים במהלך סינתזת החלבון מספק שכבה נוספת של בקרת ביטוי הכרחי לתגובה מהירה בשינוי תנאי. Polysome (או “polyribosome”) שימוש בפרופילים, את ההפרדה והדמיה של פעיל תרגום הריבוזומים, היא שיטה חזקה ללמוד ברגולציה של סינתזת החלבון. למרות, יישומים ניסיוני הראשון שלו הופיע של שנות ה-603, פרופיל polysome נחשב כיום לאחד הטכניקות החשובות חלבון תרגום מחקרים4. MRNAs יחיד יכול להיות מתורגם על ידי אחד או יותר ריבוזום שמוביל היווצרות polysome. תעתיקים יכול להיות התעכב על הריבוזומים עם cycloheximide5 ו mRNAs המכיל מספר שונה של polysomes ניתן להפריד בתהליך polysome fractionation על ידי סוכרוז הדרגתיות ultracentrifugation6,7 , 8 , 9. ניתוח RNA של שברים polysomal מכן מאפשרת מדידה של שינויים בארצות translational של הפרט mRNAs בקנה מידה הגנום כולו, ובמהלך מצבים פיזיולוגיים שונים4,7, 10. השיטה שימש גם כדי לחשוף את התפקידים של 5′ UTR, 3′ UTR רצפי הבקרה של ה-mRNA translatability11, לבחון את תפקיד miRNAs דיכוי translational12, שמתוכננות לגלות פגמים בריבוזום להן13 , ולהבין את התפקיד של הריבוזום-הקשורים חלבונים עם מחלות אנושיות14,15. במהלך העשור האחרון, תפקיד גדל והולך עבור בקרת גנים במהלך התרגום התפתחה הממחיש את חשיבותו של מחלות אנושיות. העדויות על בקרה translational ב סרטן, מטבוליות, מחלות ניווניות הוא המכריע15,16,17,18. לדוגמה, dysregulation של שליטה translational תלויי-eIF4E תורמת אוטיזם הקשורים גירעונות15 ו- FMRP מעורב השתהות של הריבוזומים על mRNAs קשורה לאוטיזם14. לפיכך, פרופיל polysomal הוא כלי מאוד חשוב ללמוד פגמים בתקנה translational מחלות אנושיות מרובות.
אנליזת חלבונים שברים polysomal בתנאים פיזיולוגיים שונים מבתר את הפונקציה של גורמים הקשורים הריבוזומים במהלך התרגום. הטכניקה פרופיל polysome שימש במינים רבים, לרבות שמרים בתרבית של תאים, צמחים, חד-תאיים10,19,20,21. טפילים protozoan כמו Trypanosoma ולישמניה להפגין שליטה מוגבלת תעתיק של ביטוי גנים. הגנום שלהם מאורגנות אשכולות גנים polycistronic חסרי שעתוק מקדם מוסדר22. במקום זאת, ביטוי גנים התפתחותית נשלטת בעיקר ברמה של חלבון תרגום ויציבות mRNA trypanosomatid מינים23,24. לכן, הבנה של שליטה translational בהעדר רגולציה תעתיק זה חשוב במיוחד עבור אורגניזמים אלה. פרופיל polysomal הוא כלי רב עוצמה כדי ללמוד posttranscriptional בקרת גנים לישמניה25,26,27,28.
התקדמות האחרונות בזיהוי של רמות mRNAs בודדים על-ידי אמת בפעם ה-PCR כמותי (RT-qPCR), transcriptome מלאה על ידי רצף הדור הבא, כמו גם טכנולוגיות פרוטאומיקס, מביא את הרזולוציה ואת היתרונות של פרופיל polysomal לרמה חדשה. השימוש בשיטות אלה ניתן להרחיב הלאה על ידי רצף הרנ א עמוק בשילוב עם ניתוח פרוטיאומיה מבנית כדי לפקח על מצב translational של תאים בקנה מידה הגנום כולו על ידי ניתוח של שברים polysomal בודדים. דבר זה מאפשר זיהוי שחקנים מולקולריים חדשים ויסות תרגום בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים. כאן, אנו מציגים polysome האוניברסלית של פרופיל פרוטוקול המשמש על שלושה דגמים שונים: טפיל לישמניה הגדולות, בתרבית תאים אנושיים, רקמות חיות. אנו מציגים את העצה על הכנת תא lysates אורגניזמים שונים, אופטימיזציה של תנאי מעבר צבע, הבחירה של מעכבי RNase ויישום של RT-qPCR, תספיג ו RNA אלקטרופורזה לנתח שברים polysome במחקר זה.
Protocol
Representative Results
Discussion
Polysome fractionation על ידי הדרגה סוכרוז בשילוב עם ה-RNA, אנליזת חלבונים שברים היא שיטה חזקה כדי לנתח מצב translational mRNAs בודד או כל translatome, כמו גם תפקידים של חלבון גורמי ויסות translational מכונות במהלך למצב רגיל פיזיולוגיים או מחלה. פרופיל polysomal היא טכניקה מתאים במיוחד ללמוד תקנה translational אורגניזמים כגון trypanosomat…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לי צ’ינג על עזרה עם הקלטת אודיו. המחקר נתמך על ידי ראשונית של טקסס טק האוניברסיטה למדעי הבריאות מרכז, על ידי מרכז המצוינות במדעי המוח Translational ו הרפוי (CTNT) להעניק PN-CTNT 2017-05 AKHRJDHW A.L.K.; בחלקו על ידי מענק NIH R01AI099380 ג’יימס K.Z. ג האפמן, קריסטין ר’ באקה היו מלומדים CISER (מרכז עבור אינטגרציה של גזע חינוך & מחקר), נתמכו על-ידי התוכנית.
Materials
| Instruments: | ||
| Gradient master | Biocomp Instruments Inc. | 108 |
| Piston Gradient Fractionator | Biocomp Instruments Inc. | 152 |
| Fraction collector | Gilson, Inc. | FC203B |
| NanoDrop One | Thermo Scientific | NanoDrop One |
| Nikon inverted microscope | Nikon | ECLIPSE Ts2-FL/Ts2 |
| 2720 Thermal Cycler | Applied Biosystems by Life Technologies | 4359659 |
| CO2 incubator | Panasonic Healthcare Co. | MCO-170A1CUV |
| HERATHERM incubator | Thermo Scientific | 51028063 |
| Biological Safety Cabinet, class II, type A2 | NuAire Inc. | NU-543-400 |
| Revco freezer | Revco Technologies | ULT1386-5-D35 |
| Beckman L8-M Ultracentifuge | Beckman Coulter | L8M-70 |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 |
| Ultracentrifuge Rotor SW41 | Beckman Coulter | 331362 |
| Swing-bucket rotor | Eppendorf | A-4-62 |
| Fixed angle rotor | Eppendorf | F-45-30-11 |
| Quant Studio 12K Flex Real-Time PCR machine 285880228 | Applied Biosystems by life technologies | 4470661 |
| TC20 Automated cell counter | Bio-Rad | 145-0102 |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 02-671-51B |
| Software | ||
| Triax software | Biocomp Instruments Inc. | |
| Materials: | ||
| Counting slides, dual chamber for cell counter | Bio-Rad | 145-0011 |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | USA Scientific | 1615-5500 |
| Open-top polyclear centrifuge tubes, (14 mm x 89 mm) | Seton Scientific | 7030 |
| Syringe, 5 mL | BD | 309646 |
| BD Syringe 3 mL23 Gauge 1 Inch Needle | BD | 10020439 |
| Nunclon Delta Surface plate, 14 cm | Thermo Scientific | 168381 |
| Nunclon Delta Surface plate, 9 cm | Thermo Scientific | 172931 |
| Nalgene rapid-flow 90mm filter unit, 500 mL, 0.2 aPES | Thermo Scientific | 569-0020 |
| BioLite 75 cm3 flasks | Thermo Scientific | 130193 |
| Nunc 50 mL conical centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339653 |
| Chemicals: | ||
| Trizol LS | Ambion by Life Technologies | 10296028 |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 |
| Trizma base | Sigma | T1378-5KG |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium-high glucose (DMEM) | Sigma | D6429-500ML |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F0926-50ML |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | Sigma | P0781-100ML |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Sigma | D8537-500ML |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2x6H2O) | Acros Organics | AC413415000 |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma | P9541-500G |
| Nonidet P 40 (NP-40) | Fluka (Sigma-Aldrich) | 74385 |
| Recombinant Rnasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2511 |
| Heparin sodium salt | Sigma | H3993-1MU |
| cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitors | Roche Diagnostics | 11836170001 |
| Glycogen | Thermo Scientific | R0551 |
| Water | Sigma | W4502-1L |
| Cycloheximide | Sigma | C7698-1G |
| Chloroform | Fisher Scientific | 194002 |
| Dithiotreitol (DTT) | Fisher Scientific | BP172-5 |
| Ethidium Bromide | Fisher Scientific | BP-1302-10 |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium dehydrate (EDTA) | Fisher Scientific | S316-212 |
| Optimem | Life Technologies | 22600050 |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma | P8833-100MG |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3KG |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T4049-100ML |
| Hgh Capacity cDNA Reverse Transcriptase Kit | Applied Biosystems by life technologies | 4368814 |
| Power SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems by life technologies | 4367659 |
| HCl | Fisher Scientific | A144SI-212 |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP26324 |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma | 221473-500G |
| Anti-RPL11 antibody | Abcam | ab79352 |
| Ribosomal protein S6 (C-8) antibody | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-74459 |
| 1xM199 | Sigma | M0393-10X1L |
| Lithium cloride | Sigma | L-9650 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 |
| Gel Loading Buffer II | Thermo Scientific | AM8546G |
| UltraPure Agarose | Thermo Scientific | 16500-100 |
| Trichloracetic acid (TCA) | Fisher Scientific | A322-100 |
| SuperSignal West Pico PLUS chemiluminescent substrate | Thermo Scientific | 34580 |
| Formaldehyde | Fisher Scientific | BP531-500 |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma | L5750-1KG |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626-5G |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma | A1852-1VL |
| Cytosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (CTP) | Sigma | C1506-250MG |
| Uridine 5'-triphosphate trisodium salt hydrate (UTP) | Sigma | U6625-100MG |
| Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate (GTP) | Sigma | G8877-250MG |
| SP6 RNA Polymerase | NEB | M0207S |
| Pyrophoshatase | Sigma | I1643-500UN |
| Spermidine | Sigma | S0266-1G |
References
- Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
- Capewell, P., et al. Regulation of Trypanosoma brucei Total and Polysomal mRNA during Development within Its Mammalian Host. PLoS One. 8 (6), e67069 (2013).
- Warner, J. R., Knopf, P. M., Rich, A. A multiple ribosomal structure in protein synthesis. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 49, 122-129 (1963).
- Piccirillo, C. A., Bjur, E., Topisirovic, I., Sonenberg, N., Larsson, O. Translational control of immune responses: from transcripts to translatomes. Nature Immunology. 15 (6), 503-511 (2014).
- Ennis, H. L., Lubin, M. Cycloheximide: Aspects of Inhibition of Protein Synthesis in Mammalian Cells. Science. 146 (3650), 1474-1476 (1964).
- Masek, T., Valasek, L., Pospisek, M. Polysome analysis and RNA purification from sucrose gradients. Methods in Molecular Biology. 703, 293-309 (2011).
- Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. Journal of Visualized Experiments. (87), (2014).
- Zuccotti, P., Modelska, A. Studying the Translatome with Polysome Profiling. Methods in Molecular Biology. 1358, 59-69 (2016).
- Chasse, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Research. 45 (3), e15 (2017).
- Arava, Y., et al. Genome-wide analysis of mRNA translation profiles in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 100 (7), 3889-3894 (2003).
- Gandin, V., et al. nanoCAGE reveals 5′ UTR features that define specific modes of translation of functionally related MTOR-sensitive mRNAs. Genome Research. 26 (5), 636-648 (2016).
- Bazzini, A. A., Lee, M. T., Giraldez, A. J. Ribosome profiling shows that miR-430 reduces translation before causing mRNA decay in zebrafish. Science. 336 (6078), 233-237 (2012).
- Zanchin, N. I., Goldfarb, D. S. Nip7p interacts with Nop8p, an essential nucleolar protein required for 60S ribosome biogenesis, and the exosome subunit Rrp43p. Molecular Cell Biology. 19 (2), 1518-1525 (1999).
- Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146 (2), 247-261 (2011).
- Gkogkas, C. G., et al. Autism-related deficits via dysregulated eIF4E-dependent translational control. Nature. 493 (7432), 371-377 (2013).
- Robichaud, N., Sonenberg, N. Translational control and the cancer cell response to stress. Curr Opin Cell Biol. 45, 102-109 (2017).
- Gordon, B. S., Kelleher, A. R., Kimball, S. R. Regulation of muscle protein synthesis and the effects of catabolic states. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 45 (10), 2147-2157 (2013).
- Ishimura, R., et al. RNA function. Ribosome stalling induced by mutation of a CNS-specific tRNA causes neurodegeneration. Science. 345 (6195), 455-459 (2014).
- Petersen, C. P., Bordeleau, M. E., Pelletier, J., Sharp, P. A. Short RNAs repress translation after initiation in mammalian cells. Molecular Cell. 21 (4), 533-542 (2006).
- Juntawong, P., Girke, T., Bazin, J., Bailey-Serres, J. Translational dynamics revealed by genome-wide profiling of ribosome footprints in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 111 (1), E203-E212 (2014).
- Bunnik, E. M., et al. Polysome profiling reveals translational control of gene expression in the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Genome Biology. 14 (11), R128 (2013).
- De Gaudenzi, J. G., Noe, G., Campo, V. A., Frasch, A. C., Cassola, A. Gene expression regulation in trypanosomatids. Essays in Biochemistry. 51, 31-46 (2011).
- Alves, L. R., Goldenberg, S. RNA-binding proteins related to stress response and differentiation in protozoa. World Journal of Biological Chemistry. 7 (1), 78-87 (2016).
- De Pablos, L. M., Ferreira, T. R., Walrad, P. B. Developmental differentiation in Leishmania lifecycle progression: post-transcriptional control conducts the orchestra. Current Opinions in Microbiology. 34, 82-89 (2016).
- Soto, M., et al. Cell-cycle-dependent translation of histone mRNAs is the key control point for regulation of histone biosynthesis in Leishmania infantum. Biochemical Journal. 379, 617-625 (2004).
- McNicoll, F., et al. Distinct 3 ‘-untranslated region elements regulate stage-specific mRNA accumulation and translation in Leishmania. Journal of Biological Chemistry. 280 (42), 35238-35246 (2005).
- Folgueira, C., et al. The translational efficiencies of the two Leishmania infantum HSP70 mRNAs, differing in their 3 ‘-untranslated regions, are affected by shifts in the temperature of growth through different mechanisms. Journal of Biological Chemistry. 280 (42), 35172-35183 (2005).
- Dumas, C., Chow, C., Muller, M., Papadopoulou, B. A novel class of developmentally regulated noncoding RNAs in Leishmania. Eukaryotic Cell. 5 (12), 2033-2046 (2006).
- Kapler, G. M., Coburn, C. M., Beverley, S. M. Stable transfection of the human parasite Leishmania major delineates a 30-kilobase region sufficient for extrachromosomal replication and expression. Molecular Cell Biology. 10 (3), 1084-1094 (1990).
- Karamyshev, A. L., Johnson, A. E. Selective SecA association with signal sequences in ribosome-bound nascent chains: a potential role for SecA in ribosome targeting to the bacterial membrane. Journal of Biological Chemistry. 280 (45), 37930-37940 (2005).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
- Panda, A. C., Martindale, J. L., Gorospe, M. Polysome Fractionation to Analyze mRNA Distribution Profiles. Bio Protocols. 7 (3), (2017).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular Cloning. A Laboratory Manual. , (1989).
- Patrick, A. E., Karamyshev, A. L., Millen, L., Thomas, P. J. Alteration of CFTR transmembrane span integration by disease-causing mutations. Molecular Biology of the Cell. 22 (23), 4461-4471 (2011).
- Kleizen, B., van Vlijmen, T., de Jonge, H. R., Braakman, I. Folding of CFTR is predominantly cotranslational. Molecular Cell. 20 (2), 277-287 (2005).
- van den Elzen, A. M., Schuller, A., Green, R., Seraphin, B. Dom34-Hbs1 mediated dissociation of inactive 80S ribosomes promotes restart of translation after stress. EMBO Journal. 33 (3), 265-276 (2014).
- Morita, M., et al. mTOR Controls Mitochondrial Dynamics and Cell Survival via MTFP1. Molecular Cell. 67 (6), 922-935 (2017).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
