Lentiviral aracılı transgenik fareler üretimi: doğrudan eğitim kurucuları basit ve son derece etkili bir yöntem
Summary
Burada, lentiviral bir vektör perivitelline alanda bir döllenmiş yumurta, basit bir iğne ile transgene entegrasyon ve kurucusu transgenik fareler ile yüksek etkinlik üretimini teşvik için bir protokol mevcut.
Abstract
Yaklaşık 40 yıldır, pronuclear DNA enjeksiyon transgenes rasgele entegrasyonu ile transgenik fareler oluşturmak için standart yöntem temsil eder. Rutin bir işlem tüm dünyada yaygın olarak kullanılmaktadır ve kurucusu hayvanlar bir düşük verim içinde kaynaklanan transgene tümleştirme, zavallı etkinliği, onun ana sınırlama bulunur. Sadece birkaç yüzde enjekte döllenmiş yumurta implantasyonu sonra doğan hayvanların transgene entegre etmiş. Buna ek olarak, lentiviral vektörler bütünleştirici gen transferi için güçlü araçlar ve kullanımları döllenmiş yumurta transduce kurucusu yüksek verimli üretim % 70 üzerinde bir ortalama verim ile transgenik fareler sağlar. Ayrıca, herhangi bir fare zorlanma transgenik hayvan üretmek için kullanılabilir ve alellerle transgene ifade son derece yüksek, DNA mikroenjeksiyon karşılaştırıldığında lentiviral aracılı transgenesis ile % 80’i yukarıda. Kargo lentiviral vektör tarafından olabilir DNA parçasının boyutunu 10 kb ile sınırlı ve bu yöntemin büyük sınırlama temsil eder. Basit ve kolay enjeksiyon yordamı döllenmiş yumurta zona pelusida altında gerçekleştirmek kullanarak, 50’den fazla kurucusu hayvanlar mikroenjeksiyon tek bir oturumda üretilebilir. Böyle bir yöntem, doğrudan kurucusu hayvanlar, hızlı kazanç ve kayıp işlev çalışmaların veya ekran genomik DNA bölgeleri kontrol eden ve düzenleyen gen ifade içinde vivoyeteneklerini için gerçekleştirmek için son derece adapte.
Introduction
Gordon ve ark. öncü çalışmaları 1980 yılında pseudopregnant farelerde implantasyon sonra döllenmiş yumurta plazmid DNA enjeksiyon erkek pronuclei içine entegre transjenik hayvanlar üretimini getirebilecek gösterdi Plazmid DNA1. Transgenik memeliler oluşturulabilir gösteri küresel Yaşam Bilimleri Araştırma temel bilimler ve çevirim Biyomedikal Bilimler için hem de Roman alanlara yol açarak üzerinde çok büyük etkisi vardı. Son dört yıl içinde DNA mikroenjeksiyon rutin bir uygulama haline gelmiştir. Transgenik fareler çok büyük sayıda üretilen rağmen standart yöntem tam olarak tüm fare suşları için kullanılamaz ve zaman alıcı backcrosses2,3gerektirir. Uygulama diğer türler için zorlu4 kalır ve genel transgene tümleştirme verim d. hayvan5birkaç yüzdesine sınırlıdır. Buna ek olarak, transgene tümleştirme etkinliğini pronuclear DNA enjeksiyon zavallı genel verimi açıklayan sınırlayıcı bir faktör temsil eder. Bu açıdan bütünleştirici viral vektörler en verimli araçlar için kargo ve transgenes entegre ve böylece önemli ölçüde entegrasyon verim, bu 10 kb6 aşamaz transgene boyutu olmak tek sınırlama artırmak için yeni araç sağlayabilir .
Lentiviral vektörler ile örtmek protein Vesicular Stomatit virüs (VSV) sözde yazılı pantropic ve son derece bütünleştirici gen transferi araçlardır ve döllenmiş yumurta7transduce için kullanılabilir. Yumurtalar çevreleyen zona pelusida doğal virüs engeldir ve iletim lentiviral vektörler ile izin vermek için geçirilmesi gerekiyor. Transjenik hayvanlar tarafından transducing döllenmiş yumurta mikro delme veya zona pelusida8,9/ kaldırma sonra üretilmedi. Ancak, enjeksiyon perivitelline uzayda zona pelusida altında başlangıçta Lois ve meslektaşları7tarafından tanımlandığı gibi döllenmiş yumurta transduce için en basit yöntem gibi görünüyor.
Perivitelline enjeksiyon lentiviral vektörlerin d. hayvanların % 70 transjenik hayvanlar üretiminde yüksek verim sağlar. Böyle verim standart pronuclei DNA enjeksiyon7,10,11kullanılarak elde edilebilir en iyi verim fazla 10 kat daha yüksektir. Bu bağlamda, en az 50 transgenik kurucuları (F0) enjeksiyonları tek bir oturum oluşturur. Kurucuları çok sayıda, bu nedenle, fenotipleme doğrudan transgenik fare satırları oluşturmak için gerek kalmadan F0 fareler üzerinde gerçekleştirilen transgene etkisi ile uyumludur. Bu avantaj ve in vivo kazanç ve kayıp işlev çalışmaların hafta içinde gerçekleştirmek için özel olarak adapte transgene etkisi hızlı tarama için sağlar. Ayrıca, düzenleyici DNA elemanlarının da hızla arttırıcılar ve transkripsiyon faktörleri11,12‘ bağlı DNA motifleri eşlemek için taramaya tabi. Pronuclear iğne ile transgenes genellikle benzersiz bir odağı olarak birden çok kopya entegre. Lentiviral vektörler ile tümleştirme, locus10,13başına tek kopya olarak birden çok loci oluşur. Bu nedenle, tümleşik loci çokluğu yeni oluşturulan modeli daha sağlam yapar transgenik kurucuları gözlenen çok yüksek ifade alellerle ilgili olabilir.
Önemlisi, DNA’ın pronuclear enjeksiyon kullanırken, pronuclei görselleştirme işlemi sırasında kesinlikle gereklidir. Bu teknik sınırlama döllenmiş yumurta çok çeşitli fare suşları kaynaklanan kullanımını engeller. Bu nedenle, belirli bir transgenik bir modelde üretim için hangi pronuclei görünmez istenen fare transgene aktarmak için en az 10 ardışık backcrosses ardından izin veren bir yük hayvanlarda üretimini gerektirir zorlanma zorlanma. Lentiviral vektör enjeksiyonları ile perivitelline alanı her zaman görünür ve enjeksiyon çok özel beceri gerektirmez. Örnek olarak, pronuclei enjeksiyon için uygun değildir NOD/SCID transgenik fareler viral vektör enjeksiyonları14ile elde edilmiştir.
Burada, kapsamlı bir protokol transgenik fareler bir hücre sahne embriyo perivitelline uzayda lentiviral vektör enjeksiyonlar kullanarak basit üretim izin için sunulmuştur. İkisinden biri ile kontrollü Transgene ifade her yerde veya hücre belirli Rehberleri ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
PTrip ΔU3 lentiviral omurga bu çalışma15dakika içinde kullanıldı. Bu vektör içinde U3 sıra kısmen U3 organizatörü etkinliğini kaldırmak ve kendi kendine inactivating bir vektör (günah)16oluşturmak için silinene kadar çoğaltma arızalı lentiviral vektörler üretmek için izin verir. Lentiviral vektör stokları HEK-293T hücre p8.91 kapsülleme plazmid (ΔVpr ΔVif ΔVpu ΔNef)6, pHCMV-G vesicular Stomatit virüs (VSV) glikoprotein-G17ve pTRIP ΔU3 kodlama ile geçici transfection tarafından üretildi Rekombinant vektör. Detaylı üretim yordamı tamamlayıcı yöntemler sağlanır.
Üretim yüksek titresi lentiviral vektör stoklarının Biyogüvenlik seviye II koşullarda (BSL-2) gerçekleştirilir. Bu BSL-3’te üretilmiş olmalıdır oncogenes dışında çoğu transgenes için geçerlidir. Bu nedenle, üretim BSL-2 koşullarda çoğu için yeterlidir. Buna ek olarak, kullanım ve üretim genellikle çoğu ulusal düzenleyici kurumlar genetiği değiştirilmiş organizmalar (GDO) ile başa çıkmak için kesilir. Çoğaltma beceriksiz günah lentiviral vektörler (aşağıda 2 µg p24 kapsid protein) sınırlı miktarda Fransızca GDO Ajansı ile anlaşma Avrupa Birliği’nin önerileri tarafından açıklandığı gibi BSL-1 koşullar altında kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lentiviral vektörler döllü yumurta burada açıklanan perivitelline enjeksiyon transgenik embriyo toplam toplanan embriyo sayısına oranla % 70’den fazla vermiştir transgenik embriyo üretimini sonuçlandı. Bu sonuç önceki raporları ile tutarlı olacak ve özgüllük yordam2,7,10,11,12örneğidir. Önemli özellikleri Tablo 1‘ de sunu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Magali Dumont ve Rolando Meloni lentiviral vektör üretim ve hayvan sırasıyla konut teknik yardım için el yazması ve iVector ve Phenoparc ICM çekirdek eleştirel okuma için teşekkür ederiz. Bu eser Institut Universitaire Hospitalo de sinir Translationnelles de tarafından desteklenen Paris, IHU-A-ICM, Investissements d’Avenir ANR-10 / IAIHU / 06. Alınan Halkla İlişkiler Derneği de Langue Française için finansman dökün l’Etude du Diabète et des Maladies Métaboliques (ALFEDIAM) ve ortak bir JDRF / INSERM verin.
Materials
| PMSG 50UI | Sigma | G4527 | |
| hCG 5000UI | Sigma | CG5-1VL | |
| NaCl | Sigma | 7982 | |
| 100 mm petri dish | Dutsher | 353003 | |
| 4 wells Nunc dish | Dutsher | 56469 | IVF dish |
| M2 medium | Sigma | M7167 | |
| M16 medium | Sigma | M7292 | |
| 0,22 µm Syringe filter | Dutsher | 146611 | |
| Hyaluronidase Enzyme 30mg | Sigma | H4272 | mouse embryo tested |
| Insulin serynge | VWR | 613-3867 | Terumo Myjector |
| Curved forceps | Moria | 2183 | |
| Curved scissors | Moria | MC26 | |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177-5EA | |
| Borosilicate glass capillaries | Harvard apparatus | GC 100-10 | |
| Horizontal micropipette puller | Narishige | PN-30 | |
| Microforge | Narishige | MF-900 | |
| Inverted microscope | Nikon | Transferman NK2 5188 | Hoffman modulation contrast illumination is required |
| Micromanipulator | Eppendorf | Celltram air | |
| Controler of holding pipet | Eppendorf | Femtojet | |
| Mineral oil | Sigma | M8410 | mouse embryo tested |
| Microinjector | Eppendorf | Femtojet | Can be used to inject DNA or viral vectors |
| Dumont # 5 forceps | Moria | MC 40 | |
| vannas micro scissors | Moria | 9600 | |
| Isoflurane | centravet | ISO005 | ISO-VET 100% 250ml |
| ocrygel | centravet | OCR002 | |
| Povidone iodure | centravet | VET001 | vetedine 120ml |
| Buprenorphine | centravet | BUP002 | Buprecare 0,3Mg/ml 10ml |
| Tris-HCl | Sigma | T5941 | Trizma hydrochloride |
| EDTA | Sigma | E9884 | |
| SDS | Sigma | 436143 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | powder |
| proteinase K | Sigma | P2308 | |
| oneTaq kit | NEB | M0480L | |
| Primers | Eurogentec | ||
| Strip of 8 PCR tube | 4titude | 4ti-0781 | |
| 96 well thermal cycler | Applied Biosystems | 4375786 | Veriti |
| Genomic DNA mini kit | invitrogen | K1820-02 | |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000C | |
| qPCR Master mix | Roche | 4887352001 | SYBR Green |
| Multiwell plate 384 | Roche | 5217555001 | |
| qPCR instrument 384 well | Roche | 5015243001 | LightCycler 480 |
References
- Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proceedings of the National Academy of Science USA. 77 (12), 7380-7384 (1980).
- Bock, T. A., Orlic, D., Dunbar, C. E., Broxmeyer, H. E., Bodine, D. M. Improved engraftment of human hematopoietic cells in severe combined immunodeficient (SCID) mice carrying human cytokine transgenes. Journal of Experimental Medicine. 182 (6), 2037-2043 (1995).
- Miyakawa, Y., et al. Establishment of human granulocyte-macrophage colony stimulating factor producing transgenic SCID mice. British Journal of Haematology. 95 (3), 437-442 (1996).
- Hirabayashi, M., et al. A comparative study on the integration of exogenous DNA into mouse, rat, rabbit, and pig genomes. Experimental Animals. 50 (2), 125-131 (2001).
- Isola, L. M., Gordon, J. W. Transgenic animals: a new era in developmental biology and medicine. Biotechnology. 16, 3-20 (1991).
- Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo. Nature Biotechnology. 15 (9), 871-875 (1997).
- Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors. Science. 295 (5556), 868-872 (2002).
- Ewerling, S., et al. Evaluation of laser-assisted lentiviral transgenesis in bovine. Transgenic Research. 15 (4), 447-454 (2006).
- Ritchie, W. A., Neil, C., King, T., Whitelaw, C. B. Transgenic embryos and mice produced from low titre lentiviral vectors. Transgenic Research. 16 (5), 661-664 (2007).
- Park, F. Lentiviral vectors: are they the future of animal transgenesis. Physiological Genomics. 31 (2), 159-173 (2007).
- van Arensbergen, J., et al. A distal intergenic region controls pancreatic endocrine differentiation by acting as a transcriptional enhancer and as a polycomb response element. PLoS One. 12 (2), e0171508 (2017).
- Friedli, M., et al. A systematic enhancer screen using lentivector transgenesis identifies conserved and non-conserved functional elements at the Olig1 and Olig2 locus. PLoS One. 5 (12), e15741 (2010).
- Sauvain, M. O., et al. Genotypic features of lentivirus transgenic mice. Journal of Virology. 82 (14), 7111-7119 (2008).
- Punzon, I., Criado, L. M., Serrano, A., Serrano, F., Bernad, A. Highly efficient lentiviral-mediated human cytokine transgenesis on the NOD/scid background. Blood. 103 (2), 580-582 (2004).
- Zennou, V., et al. The HIV-1 DNA flap stimulates HIV vector-mediated cell transduction in the brain. Nature Biotechnology. 19 (5), 446-450 (2001).
- Miyoshi, H., Blomer, U., Takahashi, M., Gage, F. H., Verma, I. M. Development of a self-inactivating lentivirus vector. Journal of Virology. 72 (10), 8150-8157 (1998).
- Yee, J. K., et al. A general method for the generation of high-titer, pantropic retroviral vectors: highly efficient infection of primary hepatocytes. Proceedings of the National Academy of Science USA. 91 (20), 9564-9568 (1994).
- Castaing, M., et al. Efficient restricted gene expression in beta cells by lentivirus-mediated gene transfer into pancreatic stem/progenitor cells. Diabetologia. 48 (4), 709-719 (2005).
- Gradwohl, G., Dierich, A., LeMeur, M., Guillemot, F. neurogenin3 is required for the development of the four endocrine cell lineages of the pancreas. Proceedings of the National Academy of Science USA. 97 (4), 1607-1611 (2000).
- Scharfmann, R., Axelrod, J. H., Verma, I. M. Long-term in vivo expression of retrovirus-mediated gene transfer in mouse fibroblast implants. Proceedings of the National Academy of Science USA. 88 (11), 4626-4630 (1991).
- Norrman, K., et al. Quantitative comparison of constitutive promoters in human ES cells. PLoS One. 5 (8), e12413 (2010).
- Vandegraaff, N., Kumar, R., Burrell, C. J., Li, P. Kinetics of human immunodeficiency virus type 1 (HIV) DNA integration in acutely infected cells as determined using a novel assay for detection of integrated HIV DNA. Journal of Virology. 75 (22), 11253-11260 (2001).
- Ohtsuka, M., et al. One-step generation of multiple transgenic mouse lines using an improved Pronuclear Injection-based Targeted Transgenesis (i-PITT). BMC Genomics. 16, 274 (2015).
- Tasic, B., et al. Site-specific integrase-mediated transgenesis in mice via pronuclear injection. Proceedings of the National Academy of Science USA. 108 (19), 7902-7907 (2011).
- Sumiyama, K., Kawakami, K., Yagita, K. A simple and highly efficient transgenesis method in mice with the Tol2 transposon system and cytoplasmic microinjection. Genomics. 95 (5), 306-311 (2010).
- Garrels, W., et al. Cytoplasmic injection of murine zygotes with Sleeping Beauty transposon plasmids and minicircles results in the efficient generation of germline transgenic mice. Biotechnology Journal. 11 (1), 178-184 (2016).
- Ding, S., et al. Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice. Cell. 122 (3), 473-483 (2005).
- Aida, T., et al. Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice. Genome Biology. 16, (2015).
- Philippe, S., et al. Lentiviral vectors with a defective integrase allow efficient and sustained transgene expression in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Science USA. 103 (47), 17684-17689 (2006).
